研究目的肝癌是世界最常见的恶性肿瘤之一,无论是发病率还是致死率均排在前列。我国是肝癌发生的重灾区,约占全世界肝癌发生率的55%,已经成为严重威胁我国人民健康和生命的重要疾病之一。目前用于肝癌治疗的手段主要包括手术、放疗和化疗等,但是疗效都不理想,副作用明显,且肿瘤极易复发和转移,患者预后较差。近年来,伴随分子生物技术和免疫学的飞速发展,肿瘤生物治疗作为一种安全、有效的治疗手段,在肿瘤综合治疗中的作用越来越突出,已逐步发展为继手术、化疗和放疗之后的第四大治疗方法。肿瘤生物治疗是一类应用细胞生物学和分子生物学手段对机体免疫系统或肿瘤的生长进行调节,从而抑制肿瘤生长的治疗方法。具有特异性强、效果确切、毒副作用低、防止癌症术后复发效果显著、远期抗癌效果良好等优点。近年来,肿瘤生物治疗的突破口在于寻找高效、特异性的靶点。STAT3是信号转导与转录活化因子家族的重要成员。作为一种转录因子,STAT3在许多原发性肿瘤中持续性激活并过度表达。活化的STAT3不仅能够通过调节其靶基因来促进肿瘤细胞的增殖、抑制凋亡、影响细胞周期,而且还能通过调控肿瘤细胞分泌细胞因子促进肿瘤血管生成和免疫逃逸。因此,STAT3的异常表达与肿瘤的发生发展有着密切的关系。我们前期的研究结果证实,阻断肝癌细胞中的STAT3信号通路可以明显抑制肿瘤细胞的增殖、促进肿瘤细胞凋亡。更为重要的是,阻断STAT3以后,肝癌细胞对NK细胞的杀伤敏感性明显增强,且阻断STAT3的肝癌细胞可以有效激活小鼠机体免疫系统对HCC的免疫应答,打破免疫耐受,产生有效的抗肿瘤效应。这一结果提示我们,阻断STAT3信号通路后,肝癌细胞的肿瘤抗原成分可能发生了改变,导致其免疫原性增强。因此,本研究中我们利用基因诱骗(decoy-ODN)的方法阻断肝癌细胞中的STAT3信号通路,并通过反复冻融将其制备成肿瘤疫苗。在确定该疫苗的预防效果后,系统分析了其抗肿瘤机制。结果证明,连续免疫接种疫苗三次后的小鼠能够产生很好的免疫记忆,当再次接种肿瘤细胞时,能够产生有效的抗肿瘤免疫应答,抑制肿瘤的发生和发展,延长小鼠生存期。对其抗肿瘤的机制研究发现,肿瘤疫苗能够增加机体T细胞和NK细胞的比例及活化水平,促进DC细胞的成熟与活化,诱导Thl型细胞因子的表达,诱导记忆性T淋巴细胞的产生,并抑制机体的免疫负调性细胞和分子。该研究为临床预防及治疗肿瘤提供了新的方法及实验依据。研究方法1.以不同浓度的FITC标记的Decoy-ODN对小鼠肝癌细胞H22和Hepal-6进行转染,通过流式细胞术检测转染效率,确定实验转染的最适条件。在该条件下对肝癌细胞转染Decoy-ODN后,通过Annexin-V/PI双染色法检测肿瘤细胞的凋亡情况,验证Decoy-ODN在小鼠肝癌细胞中的效应。2.小鼠肝癌细胞转染Decoy-ODN后,通过液氮反复冻融的方法将其制备成肿瘤疫苗。以H22细胞疫苗和Hepal-6细胞疫苗分别对BALB/c和C57BL/6两种小鼠模型连续免疫三次后进行荷瘤,观察小鼠肿瘤生长情况以及生存期。3.疫苗对小鼠免疫三次以后,分离小鼠各组织淋巴细胞,通过流式细胞术检测淋巴细胞各个亚群的比例和活化情况、分泌肿瘤免疫相关细胞因子的含量以及抗原递呈细胞DC的比例及其共刺激分子的表达。以此探讨免疫系统的活化状态和激活免疫反应的机制。4.疫苗对小鼠免疫三次后,分离小鼠各组织淋巴细胞,检测小鼠体内免疫记忆性淋巴细胞的比例,探讨疫苗的免疫记忆功能。并且通过体外诱导增殖实验来验证免疫记忆效果。5.疫苗免疫后荷瘤的小鼠,分离各个组织淋巴细胞,通过流式细胞术检测各淋巴细胞亚群的活化状态,以及免疫负调细胞的比例及其分泌的免疫抑制性细胞因子的含量,以此探讨机体抗肿瘤免疫的机制。6.通过无胸腺裸鼠进行疫苗免疫实验,观察荷瘤裸鼠肿瘤的生长情况以及机体免疫系统活化的水平,探讨发挥免疫记忆功能以及抗肿瘤效应的细胞亚群。7.以荷瘤小鼠的血清孵育肿瘤细胞,通过流式细胞术检测肿瘤细胞表面肿瘤特异性IgG的含量,探讨体液免疫在肿瘤清除过程中的作用。研究结果1.以100nM浓度的ODN转染小鼠肝癌细胞12h,Decoy-ODN可以有效进入肝癌细胞,并促进细胞凋亡,证明以此转染条件处理小鼠肿瘤细胞,Decoy-ODN可以发挥阻断STAT3的作用。2.经肿瘤疫苗免疫的小鼠,对其进行HCC荷瘤,发现其成瘤率明显降低,并且肿瘤的生长速度显著减缓,生存期延长。3.经疫苗免疫后,小鼠外周血T细胞和NK细胞的比例明显高于对照组,并且其活化性标志CD69的表达水平显著提高,CD4+和CD8+T细胞胞内IFN-γ和[NF-α的分泌量明显增加。进一步分析抗原递呈细胞DC的变化发现,DC细胞的比例以及其共刺激分子CD80和CD86的表达均显著高于对照组。4.通过疫苗免疫后,小鼠外周血中记忆性T细胞(CD3+CD44+CD62L+)的比例明显高于对照组。进一步分离免疫后的小鼠的脾脏淋巴细胞,在体外利用灭活的肿瘤细胞进行刺激,发现处理5天后,疫苗免疫组的脾脏淋巴细胞增殖显著增加。5.小鼠经过疫苗免疫后荷瘤,其外周血以及肿瘤浸润淋巴细胞中T细胞的比例和CD69+T比例均显著高于对照组,并且T细胞表面脱颗粒相关分子CD107a的阳性率也显著增加。虽然NK细胞比列没有显著变化,但是其CD69和CD107a表达水平均明显升高。通过分析免疫负调细胞Treg的比例及其分泌的抑制性细胞因子的含量发现,疫苗免疫的小鼠荷瘤后其外周血中Treg细胞的比例明显下降,且血清中IL-10和TGF-β的含量明显降低。6.裸鼠经疫苗免疫后荷瘤,其肿瘤生长速度与未免疫组相比无明显差别,体内淋巴细胞的活化也没有显著变化。7.血清孵育肿瘤细胞后,用anti mouse IgG抗体通过流式细胞术检测,发现IgG+的肿瘤细胞比例明显升高,表明经疫苗免疫后小鼠血清中肿瘤特异性的IgG含量明显升高了。结论及意义本课题通过基因诱骗的手段靶向阻断肝癌细胞的STAT3信号通路,然后将全细胞进行灭活,制备肿瘤疫苗并对小鼠进行免疫。结果发现,通过疫苗免疫后,小鼠的免疫系统明显活化,并且产生免疫记忆性。对经疫苗免疫的小鼠进行荷瘤,发现小鼠的成瘤率以及肿瘤生长速度明显降低,小鼠生存期延长。进一步对疫苗的抗肿瘤机制研究发现,其抗肿瘤作用是依赖T细胞的,并且体液免疫在其中也起到了一定的作用。该研究为临床预防和治疗肿瘤提供了新的策略和实验依据。