论文部分内容阅读
背景与目的：传统抗生素的毒副作用及其耐药菌株的出现，迫使人们寻找新型的抗微生物制剂。抗菌肽（antibiotics peptide, ABP）是由动物、植物、昆虫以及人体基因组编码的具有抗生素样活性的肽类物质。它是机体免疫系统的重要成分，构成宿主防御病源微生物入侵的第一道屏障。抗菌肽除了具有分子量小、热稳定性好、免疫原性较低等特点，还由于其独特的化学结构，能有效抑杀真菌、病毒、细菌、寄生虫，而不易产生耐药性，能选择性杀灭肿瘤细胞，而对人畜无毒副作用极小。因此，抗菌肽作为新药开发，具有广阔的前景。天蚕素（cecropin）是最早发现的抗菌肽，是一类富含碱性氨基酸的阳离子低分子短肽，它能抑杀真菌，对革兰氏阳性菌和阴性菌都有较高的抗性。本实验以天然的杀菌肽Cecropin基因的氨基酸序列为基础，设计并合成了类天蚕素Cecropin X基因，并在大肠杆菌中实现融合表达，经分离纯化获得Cecropin X蛋白，测定其抗菌活性，期望通过基因改造获得抗菌活性更强、抗菌范围更广的新型抗菌肽。
方法：改造天然天蚕素分子序列，设计新的类天蚕素分子序列Cecropin X。用化学合成法合成以大肠杆菌偏爱密码子编码的CecropinX基因，并做适当改造引入双酶切位点，将该基因定向插入带有相同酶切位点的融合表达质粒pGEX-5X-3的多克隆位点构建表达质粒。重组质粒转化大肠杆菌BL21，经酶切分析及PCR检测，确定阳性克隆。IPTG诱导表达融合蛋白，SDS-PAGE电泳观察表达产物。表达产物经亲和层析纯化及Factor Xa切割，得到纯度较高的抗菌肽Cecropin X，然后检测抗菌肽活性。
结果：酶切分析、PCR验证和DNA测序等证实Cecropin X基因已被正确地插入pGEX-5X-3中。重组表达质粒pGEX-5X-3-Cecropin X在大肠杆菌BL21中成功地表达了GST／Cecropin X融合蛋白，其相对分子量约为29×10<3>，表达量约占细菌总蛋白的20％。重组蛋白经亲和层析纯化及Factor Xa切割，获得纯化蛋白。纯化蛋白检测出对大肠杆菌、金色葡萄球菌有一定的抗菌活性。
结论：成功构建了抗菌肽Cecropin X基因原核表达质粒，融合蛋白得到了表达，检测出对大肠杆菌、金色葡萄球菌的抗菌活性，为进一步探讨Cecropin X的抗菌机制及抗菌效应奠定了基础。