目 的通过建立环磷酰胺诱导C57BL/6小鼠骨髓抑制的动物模型,观察健脾补血法对小鼠的白细胞、红细胞和血小板的数量、血浆因子GM-CSF、TPO、EPO、IL-2的浓度、骨髓细胞表面标记物Sca1、Lamin、C-kit、CD48+CD150+的影响,以及对外周血单核细胞和胸腺中CD3、CD4、CD8a表达水平的影响,同时分析健脾补血法对胸腺和脾的Nr f2、Nqo1、Ho1抗氧化蛋白表达的影响,进一步探讨健脾补血法对小鼠的外周血细胞及造血、免疫、抗氧化因子的影响,验证健脾补血法改善骨髓抑制和调节免疫功能的可能作用机制。内容与方法1.为了摸索环磷酰胺(CTX)诱导小鼠骨髓抑制的剂量-时间关系,通过观察小鼠的体重、胸腺和脾的脏器指数及HE染色、外周血白细胞、红细胞和血小板数、骨髓细胞中Sca1和CD34的表达变化,明确环磷酰胺诱导小鼠骨髓抑制的剂量。2.采用醇提的方法,通过高效液相分析方法对中药复方的主要成份进行分析。3.观察小鼠的一般情况、胸腺和脾的病理形态学观察。4.采用血液分析方法检测小鼠外周血细胞的类型及数量。5.采用酶联免疫吸附测定法检测小鼠血浆因子GM-CSF、TPO、EPO、IL-2的含量。6.采用流式方法检测骨髓造血干细胞中Sca1、Lamin、C-kit、CD48+CD150+和外周血单核细胞(PBMCs)中CD3、CD4、CD8a的表达。7.采用Westernblot方法检测胸腺中CD3、CD4、CD8a和脾中Nrf2、Nqo1、Ho1的蛋白含量。8.采用RT-PCR方法检测小鼠脾中Nrf2、Nqo1、Ho1 mRNA表达。9.采用HE染色检测小鼠股骨、胸腺和脾的结构变化,同时免疫组化检测脾中Nqo1、Ho1的表达。结 果1.环磷酰胺对小鼠体重的影响给药前5天各组的体重大致相同,从第5天开始CTX的两个剂量组的体重逐渐下降,其中以高剂量CTX组明显。2.环磷酰胺对小鼠胸腺的脏器指数和HE染色的影响与正常组小鼠的胸腺脏器指数比较,第2天时CTX两个剂量显著下降(P<0.01),第7天时CTX50mg/kg显著下降(P<0.01),第14天时CTX50mg/kg比其他两组仍显著下降(P<0.01)。HE染色结果显示正常组胸腺的皮质、髓质、囊腔和隔膜清晰可见,而CTX两个剂量组的胸腺结构均受到破坏,其中50mg/kg组更明显。3.环磷酰胺对小鼠脾的脏器指数和HE染色的影响与正常组比较,CTX50mg/kg组在第2天脾的脏器指数显著下降(P<0.05);与CTX25mg/kg组比较,CTX50mg/kg组明显下降(P<0.05)。第7天时,CTX50mg/kg组比其他两组明显升高(P<0.05):HE染色可见第2天时CTX50mg/kg组的脾脏中白髓萎缩、出血和坏死,第7天时脾脏恢复。4.环磷酰胺对小鼠外周血细胞数的影响与正常组比较,CTX25mg/kg和50mg/kg两个剂量组的白细胞和红细胞在第2、7、14天均显著下降(户<0.01)。血小板显著升高(P<0.05或P<0.01)。5.环磷酰胺对小鼠骨髓细胞中Sca1和CD34的影响与正常组比较,第2天CTX的两个剂量组骨髓细胞中Sca1的表达均显著下降(P<0.01),CD34的表达均显著升高(P<0.01)。与25mg/kg组比较,50mg/kg组的Sca1更显著下降(P<0.01),CD34的表达均显著升高(P<0.01)。第7天时三组的Sca1无显著差异,CTX的两个剂量组骨髓细胞中CD34的表达均显著下降(P<0.01)。第14天时CTX的两个剂量组骨髓细胞中Sca1的表达均显著升高(P<0.05或P<0.01),CD34的表达显著下降(户<0.01)。与25mg/kg组比较,50mg/kg组的Sca1更显著升高(P<0.01),CD34的表达显著下降(P<0.01)。激光共聚焦显微镜可以观察到细胞核染色(DAPI)在三组中未见明显变化,孵育Sca1-FITC(绿色)和CD34-PE(红色),与正常组比较,CTX的两个剂量组的骨髓细胞中绿色和红色荧光显著减少。6.健脾补血法中药的高效液相分析健脾补血法中药复方中检测到以黄芪、陈皮、生姜、甘草中的化合物为主。7.健脾补血法对小鼠一般情况的影响7.1体重、进食量、饮水量变化模型组的小鼠逐渐出现进食量及饮水量较其他组下降,毛发失去光泽,有的甚至出现脱毛,精神萎靡,活动量明显减少等表现。从绘制的各组小鼠体重变化曲线分析,模型组的体重呈现逐渐下降,正常对照组和阳性药物组、中药各剂量组小鼠体重变化曲线相对比较平坦。7.2健脾补血法对小鼠的胸腺、脾脏和肝脏的影响与正常对照组比较,模型组的胸腺、脾的重量和脏器指数均显著下降(P<0.01),肝脏的重量及脏器指数明显升高(P<0.01)。与模型组的胸腺比较,阳性药物组的胸腺重量升高(P<0.05),各剂量中药组的胸腺重量下降(P<0.05)。与模型组的脾脏比较,阳性药物组和各剂量中药组的脾重升高(P<0.01),中剂量中药组的脾的脏器指数升高(P<0.01)。与模型组的肝脏比较,阳性药物组和各中药剂量组肝脏重量和脏器指数下降(P<0.01)。8.健脾补血法对小鼠外周血细胞数的影响与正常对照组比较,模型组的白细胞数明显减少(P<0.01),血小板和红细胞数明显升高(P<0.01)。与模型组比较,阳性药物组和各剂量中药组均能显著提高白细胞数(P<0.01)。阳性药物组和中剂量中药组能显著升高血小板数(P<0.01),低剂量中药组却明显下降(P<0.05)。高、中剂量中药组的红细胞数明显降低(P<0.01)。9.健脾补血法对小鼠血浆因子GM-CSF、TPO、EPO和IL-2浓度的影响与正常对照组比较,模型组的血浆中GM-CSF、TPO、EPO和IL-2的浓度均显著降低(P<0.01),而阳性药物组和各剂量中药组均能显著提高GM-CSF、TPO、EPO和IL-2的浓度(P<0.01)。10.健脾补血法对小鼠骨髓细胞中Sca1、C-kit、1amin和CD48+CD150+的影响与正常对照组比较,模型组小鼠的骨髓细胞中Sca1-FITC表达明显降低(户<0· 01),而中剂量中药组能明显提高Sca1-FITC的表达(P<0.01)。与正常对照组比较,模型组骨髓细胞中C-kit-PE和Lamin-PE均显著下降(P<0.01)。与模型组比较,高剂量中药组能增强骨髓细胞中C-kit表达(户<0.01),阳性药物组和中、低剂量中药组中Lamin的表达显著下降(P<0.01)。阳性药物组和各剂量中药组均能显著增强CD48-PE 和 CD150-FITC 的表达(P<0.01)。11.健脾补血法对小鼠外周血单核细胞CD3、CD4和CD8a的影响与正常对照组比较,模型组的外周血单核细胞中CD3、CD4和CD8a的表达均明显降低(P<0.01),而阳性药物组和各剂量中药组均能显著增强外周血单核细胞中CD3、CD4和CD8a的表达(户<0.01)。12.健脾补血法对小鼠的胸腺中CD3和CD8a蛋白表达的影响与正常对照组比较,模型组的胸腺中CD3和CD8a蛋白的表达明显降低(户<0.01),而阳性药物组和各剂量中药组均能显著增加胸腺中CD3和CD8a的蛋白表达(P<0.01)。13.健脾补血法对小鼠的胸腺中Nrf2、Nqo1和Ho1蛋白表达的影响与正常对照组比较,模型组的胸腺中Nrf2、Nqo1和Ho1蛋白的表达明显升高(P<0· 01)。与模型组比较,阳性药物组的胸腺中Nrf2和Nqo1蛋白表达显著降低(P<0.01),各剂量中药组均能显著降低胸腺中Nrf2蛋白的表达(P<0.01),显著升高Nqo1和Ho1蛋白的表达(P<0.01)。14.健脾补血法对小鼠的脾中Nrf2、Nqo1和Ho1蛋白表达的影响与正常对照组比较,模型组的脾中Nrf2、Nqo1和Ho1蛋白的表达均明显升高(P<0.01)。与模型组比较,中剂量中药组脾中Nrf2蛋白的表达显著升高(户<0.01);阳性药物组和高、低剂量中药组脾中Nqo1蛋白的表达显著升高(户<0.01);阳性药物组和各剂量中药组脾中Ho1蛋白的表达显著降低(P<0.01)。15.健脾补血法对小鼠的脾中Nrf2、Nqo1和Ho1 mRNA表达的影响与正常对照组比较,模型组脾中Nrf2和Ho1 mRNA的表达显著升高(P<0.01),而Nqo1 mRNA的表达显著下降(P<0.01)。与模型组Nrf2 mRNA比较,阳性药物组和高、中剂量组均显著升高(P<0.01),低剂量中药组显著下降(P<0.01)。与模型组比较,阳性药物组和高、低剂量组的Nqo1 mRNA均显著升高(P<0.01)。与模型组Ho1 mRNA的比较,阳性药物组显著升高(户<0.01),中剂量组显著下降(P<0.01)。16.健脾补血法对小鼠的股骨、脾、肝的病理影响16.1正常对照组股骨内细胞核染色较多,核内可见多个细胞分裂,而模型组股骨内细胞核染色较少,细胞分裂数减少。各剂量中药组的股骨内细胞核染色明显增加,胞内细胞核分裂数也明显增加,以低剂量中药组明显。16.2正常对照组脾内细胞核染色较多,核染加深,而模型组脾内细胞核染色较少,核内染色数减少。各剂量中药组的脾内细胞核染色明显增加。16.3正常对照组肝内细胞核染色较多,核染加深,胞核变形,不规则,空泡较少,伴周围细胞浸润,而模型组的肝内细胞核染色较少,核内染色数减少,空泡较小。与模型组比较,各剂量中药组的肝内细胞核染色明显增加,空泡数明显减少,以中、低剂量中药组明显。17.健脾补血法对小鼠的脾中Nqo1和Ho1免疫组化的影响正常对照组的脾内Nqo1和Ho1呈阳性表达,细胞的胞浆和间隙呈现均匀的淡棕黄色。而模型组的脾内Nqo1和Ho1呈弱阳性表达,呈现少量的棕褐色。阳性药物组和各剂量中药组的脾中Nqo1和Ho1的含量明显增加,以高、中剂量中药组明显。结 论1.小剂量环磷酰胺能够对小鼠产生比较稳定的骨髓抑制作用。2.健脾补血法能够维持小鼠的体重和进食量,改善环磷酰胺的抑制状态,对小鼠股骨、脾、肝组织的局部结构具有一定的保护作用。3.健脾补血法对白细胞、血小板、红细胞均有一定的调节作用。4.健脾补血法能够提高小鼠血浆中GM-CSF、TPO和EPO的浓度,减少血细胞下降的发生。同时能够显著升高血浆中IL-2浓度,提示健脾补血法可能具有一定的抗炎作用。5.健脾补血法能够显著增强骨髓细胞中Sca1、C-kit和CD48+CD150+的表达,下调lamin的表达,提示健脾补血法可能具有增强骨髓细胞中造血干细胞数,减少造血干细胞的破坏,改善骨髓抑制的作用。6.健脾补血法具有增加小鼠外周血单核细胞中CD3、CD4和CD8a的表达,以及增强小鼠胸腺中CD3和CD8a的表达,从而减少免疫功能抑制的发生,可能起到增强机体免疫功能的作用。7.健脾补血法能够增强小鼠胸腺和脾中Nrf2、Nqo1和Ho1蛋白和mRNA的表达,增加脾内Nqo1和Ho1的免疫组化表达,提示健脾补血法可能参与Nrf2信号转导通路,增强抗氧化因子表达,可能具有减少体内发生氧化反应,增强机体的抵御能力。