第一部分益肾活血胶囊对载脂蛋白E基因敲除小鼠主动脉粥样硬化的免疫调节作用及斑块稳定性的影响研究背景动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）是严重危害人类健康的常见病,其发病率有逐年增加的趋势。众多研究表明,体液免疫和细胞免疫参与了AS形成的全过程。而且,免疫介导和炎症反应在AS的发生机制和冠心病心血管突发事件的发生中起重要作用。因此免疫调节和抗炎治疗将有望成为防治AS的重要手段之一。白细胞分化抗原40（Cell differentiation antigen 40,CD40）与其配体（CD40 ligand,CD40L,又称CD154）是一对互补跨膜糖蛋白,分别属于肿瘤坏死因子（Tumornecrosis factor,TNF）受体和TNF超家族成员,是免疫系统细胞间信息传递的主要介质,其相互作用显著影响AS相关细胞的功能,并且与斑块的发生发展及斑块的稳定性密切相关。研究发现CD40通路很可能是动脉粥样硬化发生发展过程中免疫炎症调节的上层机制。致AS抗原如氧化修饰的低密度脂蛋白（Oxidized lowdensity lipoprotein,oxLDL）,热休克蛋白60（Heat shock protein 60,HSP60）等可促进CD40/CD40L的激活与表达,CD40L与CD40结合,可诱导内皮细胞（Endothelialcells,ECs）、血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cells,VSMCs）,巨噬细胞（Macrophage,MФ）等表达产生血管细胞粘附分子-1（Vascular adhesion molecule-1,VCAM-1）、细胞间黏附分子-1（Intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1）和E-选择素（E selectin）及化学趋化因子白介素-8（Interleukin-8,IL-8）、单核细胞炎性蛋白-1和单核细胞趋化蛋白-1（Monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1）等,促进白细胞进入血管壁及平滑肌细胞向内膜的迁移与增殖。而且,CD40/CD40L相互作用还可诱导ECs、VSMCs、MΦ表达和释放基质金属蛋白酶和组织因子,促进斑块不稳定、破裂及局部血栓形成。益肾活血胶囊（Yishenhuoxue Capsule,YC）是根据导师的经验方研制而成,是临床治疗AS的有效的中药复方制剂。我们以前的研究表明其能够降低动脉粥样硬化指数,降低高同型半胱氨酸血症引起的炎症因子的高表达。但是其对CD40信号系统及斑块稳定性的影响尚不明了,本研究从体内试验探讨了益肾活血胶囊对动脉粥样硬化过程中免疫炎症因子oxLDL、CD40、基质金属蛋白酶-9（Matrixmetalloproteinase-9,MMP-9）、VCAM-1的调节作用及对动脉粥样硬化斑块稳定性的影响,以期为该药及益肾活血法治疗AS提供科学依据。目的观察益肾活血胶囊对载脂蛋白E基因敲除(Apolipoprotein E-knockout,apoE^-/-)小鼠血脂,血清oxLDL,主动脉壁的组织学及超微结构、血管壁免疫炎症因子CD40、VCAM-1和MMP-9水平以及斑块内部构成（如脂质,胶原纤维,MΦ,SMCs的含量等）的变化,探讨益肾活血胶囊对动脉粥样硬化的免疫调节作用及对动脉粥样硬化斑块稳定性的影响。方法8周龄雄性apoE^-/-小鼠45只,同种属C57BL/6J小鼠9只。apoE^-/-小鼠给予高脂饮食喂养（15%脂肪,0.25%胆固醇,84.75%基础饲料）,C57BL/6J小鼠给予普通饲料喂养,于高脂喂养12周末,将apoE^-/-小鼠随机分为模型组、益肾活血胶囊小剂量组（小剂量组）、益肾活血胶囊大剂量组（大剂量组）、辛伐他汀对照组（辛伐他汀组）和三七总皂苷对照组（三七总皂苷组）,每组9只。C57BL/6J小鼠为正常组,共6组。小剂量组和大剂量组分别给予YC 500 mg/kg,2500 mg/kg灌胃,1次/d;辛伐他汀组给予辛伐他汀3.3 mg/kg灌胃,1次/d;三七总皂苷组给予三七总皂苷60 mg/kg灌胃,1次/d;灌胃时间为12周,模型组和正常组给予生理盐水0.2 ml/只,1次/d,时间12周。于试验24周末,处死各组试验鼠,摘眼球取血1 ml,氧化酶法测定各实验组动物血清总胆固醇（Total cholesterol,TC）、低密度脂蛋白胆固醇（Low density lipoprotein cholesterol,LDL-C）、甘油三脂（Triglyceride,TG）浓度,酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）测定动物血清中oxLDL含量。用磷酸盐缓冲液（Phosphate buffer saline,PBS）从左心室逆行灌注主动脉,自主动脉根部起至胸主动脉离断主动脉,主动脉弓部约1 mm迅速投入3%戊二醛中制备透射电镜标本,余主动脉根部及主动脉弓投入4%多聚甲醛中固定,制备冰冻切片,分别行HE染色,天狼星红染色,油红O染色及SMCs、MΦ和免疫炎症因子CD40、VCAM-1、MMP-9免疫组化染色。胸主动脉迅速投入液氮中。采用实时定量RT-PCR技术检测胸主动脉CD40、VCAM-1和MMP-9的mRNA表达。采用SPSS 11.5统计软件进行统计分析。结果1.小鼠血脂测定与正常对照组相比,模型组小鼠血清TC、TG、LDL-C浓度明显升高（P均＜0.001）;大剂量组、辛伐他汀组及三七总皂苷组小鼠血脂浓度与模型组比较均有明显程度下降,其中三七总皂苷组与大剂量组下降最为显著（P均＜0.001）,其次为辛伐他汀组;小剂量组与模型组相比,除TG外,TC、LDL-C浓度与模型组相比差异无显著性（P均＞0.05）;小剂量组和大剂量组相比具有非常显著性差异（P均＜0.001）。2.小鼠血清oxLDL含量比较与正常对照组相比,模型组小鼠血清oxLDL含量明显升高（P＜0.001）;各个药物处理组小鼠oxLDL含量与模型组比较均有明显程度下降,其中大剂量组oxLDL含量下降最为显著（P＜0.001）,其次为辛伐他汀组,三七总皂苷组和小剂量组（P＜0.001,或P＜0.01）。3.apoE^-/-小鼠AS病变面积检测正常组主动脉壁光滑,完整,无AS斑块形成。apoE^-/-小鼠均见AS斑块形成,管腔呈不同程度的狭窄。斑块面积/管腔面积分别是32.54±5.13%（模型组）,26.22±4.74%（小剂量组）,14.16±5.18%（大剂量组）,14.43±4.29%（辛伐他汀组）,12.04±5.02%（三七总皂苷组）。与模型组相比,各用药组斑块面积/管腔面积比值有不同程度降低,其中大剂量组,辛伐他汀组,三七总皂苷组与小剂量组相比差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.001）。4.apoE^-/-小鼠AS斑块内部构成的变化大剂量组,辛伐他汀组和三七总皂苷组斑块内MΦ浸润及脂质含量低于模型组（P均＜0.001）,同时斑块内VSMCs含量高于模型组（P均＜0.001）。小剂量组与模型组相比,斑块内脂质含量降低（P＜0.05）,MΦ浸润水平及VSMCs含量经统计无显著差异（P＞0.05）。大剂量组与小剂量组相比,差异有显著性（P＜0.001,或P＜0.01）。大剂量组与辛伐他汀组,三七总皂苷组之间差异无显著性（P＞0.05）。5.主动脉内皮细胞超微结构改变正常组血管EC为单层扁平细胞,连续性好,胞膜平整,胞浆均匀,紧贴内弹性膜,线粒体形态结构正常。内弹性膜连续,厚度均匀。模型组EC明显肿胀,连续性中断,有明显的内皮细胞脱落现象,胞核内异染色质明显增多,边集于核膜下,线粒体明显肿胀,脊肿胀、溶解。内弹性膜有中断,厚度不均匀,可见VSMC自缺口伸入内膜。各药物处理组与模型组相比,EC形态有不同程度的改善,连续性较好,胞核形态结构基本正常,线粒体数目略增多,形态结构基本正常。内弹性膜连续,厚度均匀。6.主动脉CD40、VCAM-1、MMP-9蛋白表达水平比较（1）CD40蛋白表达比较:正常主动脉CD40表达很少,模型组小鼠血管壁CD40蛋白表达显著升高（P＜0.001）;各药物处理组CD40蛋白表达与模型组相比,有非常显著性差异（P＜0.001）;辛伐他汀组和大剂量组CD40蛋白表达明显低于小剂量组（P＜0.05）。（2）VCAM-1蛋白表达比较:与正常对照组相比,模型组小鼠血管壁VCAM-1蛋白表达显著升高（P＜0.001）;与模型组相比,各药物处理组VCAM-1蛋白表达均明显下降（P＜0.01或P＜0.05）;大剂量组与小剂量组比较,差异有统计学意义（P＜0.05）。（3）MMP-9蛋白表达比较:与正常对照组相比,模型组小鼠血管壁MMP-9蛋白表达显著升高（P＜0.001）;与模型组相比,各药物处理组MMP-9蛋白表达均明显下降（P＜0.001或P＜0.01或P＜0.05）;大剂量组、辛伐他汀组、三七总皂苷组MMP-9蛋白表达较小剂量组明显下降（P＜0.01或P＜0.05）。7.主动脉CD40、VCAM-1、MMP-9 mRNA表达水平比较（1）CD40 mRNA表达比较:与正常对照组相比,模型组小鼠血管壁CD40mRNA表达显著升高（P＜0.001）;各药物处理组CD40 mRNA表达较模型组均有不同程度下降,其中辛伐他汀组下降最为显著（P＜0.001）,其次为三七总皂苷组和大剂量组（P＜0.001）;小剂量组与大剂量组、辛伐他汀组、三七总皂苷组比较有显著差异（P＜0.001）。（2）VCAM-1 mRNA表达比较:与正常对照组相比,模型组小鼠血管壁VCAM-1mRNA表达显著升高（P＜0.001）;与模型组相比,各药物处理组VCAM-1mRNA表达均显著下降（P＜0.05或P＜0.001）;大剂量组、辛伐他汀组VCAM-1表达低于三七总皂苷组和小剂量组（P＜0.001）。（3）MMP-9 mRNA表达比较:与正常对照组相比,模型组小鼠血管壁MMP-9mRNA表达明显升高（P＜0.001）;与模型组相比,各药物处理组MMP-9 mRNA表达均显著下降（P＜0.001）;大剂量组、辛伐他汀组、三七总皂苷组与小剂量组比较,差异具有统计学意义（P＜0.001）。结论1.益肾活血胶囊能够降低apoE^-/-小鼠血脂水平。2.益肾活血胶囊能够降低apoE^-/-小鼠血清oxLDL含量。3.益肾活血胶囊抑制了免疫炎症因子CD40、MMP-9、VCAM-1的mRNA和蛋白表达。4.益肾活血胶囊对AS具有免疫调节作用,能够抑制AS的进展,抑制AS斑块由稳定向不稳定发展。其机制与降低血脂,下调oxLDL及CD40、MMP-9、VCAM-1的表达有关。第二部分益肾活血提取液对oxLDL诱导的人脐静脉内皮细胞CD40、MMP-9及VCAM-1表达的影响目的观察益肾活血提取液对oxLDL诱导的人脐静脉内皮细胞（Human umbilicalvein endothelial cells,HUVECs）CD40、MMP-9及VCAM-1表达的影响,从体外试验探讨益肾活血胶囊抗AS的机制。方法采用水煎醇沉法制备益肾活血提取液。采用胰蛋白酶液灌注消化法分离获取HUVECs并进行体外培养,取3-5代细胞进行试验。试验共分7组,空白组不予oxLDL刺激及药物处理;oxLDL刺激组（刺激组）细胞培养液中加入oxLDL（终浓度为50μg/ml）培养24 h;oxLDL+益肾活血提取液小剂量组（剂量组）、oxLDL+益肾活血提取液中剂量组（中剂量组）、oxLDL+益肾活血提取液大剂量组（大剂量组）细胞培养液中加入益肾活血提取液（终浓度分别为100μg/ml,500μg/ml,1mg/ml）培养24 h,oxLDL+辛伐他汀组（辛伐他汀组）细胞培养液中加入辛伐他汀（终浓度为10μmol/1）培养24 h,oxLDL+三七总皂苷组（三七总皂苷组）细胞培养液中加入三七总皂苷（终浓度为100μg/ml）培养24 h,后5组于药物培养24 h后加入oxLDL（终浓度为50μg/ml）继续培养24 h进行检测。采用实时定量RT-PCR检测VCAM-1的mRNA表达,免疫印迹法（Western blot）检测CD40、MMP-9的蛋白表达。试验重复3次,实验数据采用统计学方法进行分析。结果1.VCAM-1 mRNA表达水平的比较。与空白组相比,刺激组VCAM-1 mRNA表达明显增加（P＜0.001）。与刺激组相比,各药物处理组VCAM-1 mRNA表达均显著下降（P＜0.05或P＜0.001）。其中辛伐他汀组下降最为显著,其次是大剂量组、三七总皂苷组。辛伐他汀组、大剂量组与小剂量组相比,差异有统计学意义（P＜0.05）。2.CD40蛋白表达水平的比较。与空白组相比,刺激组CD40蛋白表达明显增加（P＜0.001）。与刺激组相比,除小剂量组外余各药物处理组CD40蛋白表达均显著下降（P＜0.05或P＜0.01）。其中辛伐他汀组和大剂量组下降最为显著,其次是中剂量组和三七总皂苷组。3.MMP-9蛋白表达水平的比较。与空白组相比,刺激组MMP-9的蛋白表达显著增高（P＜0.001）。与刺激组相比,各药物处理组MMP-9的蛋白表达均显著下降（P＜0.01或P＜0.001）。大剂量组、辛伐他汀组与中剂量组、三七总皂苷组和小剂量组比较,差异有统计学意义（P＜0.05,P＜0.01或P＜0.001）。结论1.oxLDL可诱导HUVECs高表达VCAM-1、CD40和MMP-9。2.给予益肾活血提取液、辛伐他汀及三七总皂苷预处理后,再给予oxLDL刺激,VCAM-1的mRNA表达降低,CD40、MMP-9的蛋白表达下降。3.随着益肾活血提取液浓度的增加,VCAM-1、CD40和MMP-9的表达呈下降趋势。提示益肾活血提取液对oxLDL诱导的免疫炎症因子的调节作用在一定范围内具有剂量依赖性。