论文部分内容阅读
本文从以下两部分进行阐述： 第一部分 高迁移率组A2(HMGA2)在HPV整合影响下的改变及其宫颈癌形成的过程中的作用 实验目的： 检测宫颈癌组织DNA中HPV整合情况、HPV和HMGA2拷贝数的变化,以及HMGA2蛋白表达分别在未病变宫颈、CIN和宫颈癌三种不同的组织中的水平,预测出HMGA2基因与宫颈恶变之间可能的关系,并探索HMGA2在宫颈癌变过程中可能起到的作用机制. 实验方法： 1.收集新鲜的宫颈癌的样本,提取DNA样本,并通过DIPS-PCR的方法检测出宫颈癌样本中的HPV整合情况以及整合位点. 2.FISH探针技术检查HMGA2和HPV在不同宫颈病变阶段的宫颈组织中的拷贝数及HPV整合在HMGA2基因位置的差异;免疫组织化学方法(IHC)检测HMGA2蛋白在无病变宫颈、CIN和宫颈癌三种组织样本中的表达量; 3.利用RT-PCR、Western技术、细胞流式检测凋亡、克隆形成等实验方法,检测过表达/沉默HMGA2基因后对于HPV16阳性的S12、SiHa和CaSki三种细胞系生长的影响,Bcl-2基因和Caspase3基因在RNA水平和蛋白水平表达的改变,探索HMGA2与宫颈癌变可能的关系及可能的机制通路. 实验结果： 1.在24个新鲜宫颈癌组织DNA样本中共检测到25个HR-HPV整合位点;HMGA2是唯一一个出现了多次的整合位点. 2.FISH技术发现HPV的拷贝数在宫颈癌组织中明显高于CIN组织,HMGA2的基因拷贝数在CIN和宫颈癌样本中没有明显变化和相关性.在同一个宫颈癌组织样本中,既可以看到HPV的DNA荧光信号,又可以看到HMGA2的荧光信号,并且两者的信号融合,证明HPV是整合在HMGA2基因上的;HMGA2基因在宫颈癌组织中蛋白表达水平明显高于其在CIN组织中的蛋白表达水平. 3.在S12、SiHa和CaSki三个细胞系上,沉默HMGA2之后,HMGA2的RNA表达明显下调了,同时蛋白水平的表达量也受到抑制,导致了宫颈癌细胞的增殖速度减慢,细胞的凋亡加快;与增殖相关的基因Bcl-2的表达在HMGA2下调以后,其在RNA水平和蛋白水平都降低了,同时凋亡相关的基因Caspase3的表达都升高了.而过表达HMGA2后,则出现了相反的结果. 实验讨论： HMGA2基因的过表达与宫颈病变从CIN向宫颈癌的转变过程中有一定的联系;HMGA2可以作为预测宫颈疾病恶性进展的一个生物学的标记物. 第二部分 基于聚β-氨基酯和HPV16靶向的CRISPR/shRNA合成纳米药物用于治疗HPV16相关宫颈恶性肿瘤 目的： 宫颈癌发生的主要原因之一是持续的HR-HPV感染.HPV致癌基因E7在HPV癌发生中起重要作用.目前,HPV疫苗不能为已经患有宫颈疾病的女性提供有效的治疗,并且定期宫颈癌筛查在缺乏医疗资源的国家和地区实施起来比较困难.我们的目标是开发基于聚(β-氨基酯)(PBAE)和HPV16E7靶向的CRISPR/shRNA的纳米颗粒,以切割或者沉默HPV16E7作为治疗HPV感染及其相关宫颈恶性肿瘤的一种治疗形式. 方法： 我们使用PBAE和质粒制造了纳米颗粒并对其表征进行了鉴定;在宫颈癌细胞系(SiHa,HeLa,CaSki,S12)和其他细胞系(HEK293)中,小鼠宫颈组织中研究纳米颗粒的毒性和细胞摄取能力.随后,将用PBAE和HPV16E7-靶向CRISPR和shRNA质粒产生的纳米粒子转染宫颈癌细胞系、组织、异种移植物和HPV16转基因小鼠以评估它们抑制HPV16E7表达和HPV16相关的宫颈恶性肿瘤的能力. 结果： 我们的纳米药物在细胞和小鼠器官中显示低毒性.通过减少HPV16E7的表达,纳米粒子可以抑制裸鼠宫颈癌细胞和异种移植瘤的生长,并逆转HPV16转基因小鼠的恶性宫颈上皮表型. 结论： 由PBAE和靶向HPV16E7质粒组成的纳米颗粒可被开发为用于治疗HPV感染及其相关的宫颈恶性肿瘤的药物.