皮肤创伤愈合(wound healing)是复杂而又有规律的修复过程,根据皮肤的不同部位,以及不同原因造成的不同损伤,创伤可以分为很多种类型,但是其创伤愈合的过程十分类似主要包括炎症反应、肉芽组织增生、组织的再生、瘢痕组织形成等阶段。对于轻度的创伤仅限于皮肤表皮层可通过上皮再生完成愈合过程,但是对于较严重的伴有皮肤和皮下组织断裂的较大伤口,以及伴有感染和各种全身性疾病的难愈合伤口,通常需要人工干预治疗,如各种细胞因子的应用、各种辅料的使用,以及皮肤修补及植皮等方式。而且皮肤附属器(毛囊、汗腺及皮脂腺)如遭完全破坏,则不能完全再生,而出现瘢痕修复。随着基础研究的深入和生物材料技术的进步,越来越多细胞因子的作用机制得以阐述并在临床应用,生物材料也在伤口部位使用预防感染和体液的流失,使得目前创伤的治疗具有更多的治疗手段和较好的疗效,但是依然不能满足临床的需求,不能解决附属器官再生问题和创伤愈合信号机制问题。Activin B是TGFβ超家族成员之一,我们前期研究发现Activin B通过调节角质形成细胞肌动蛋白的重组促进其迁移,本研究首先在在体水平探讨Activin B在创伤愈合过程中的作用,并进一步探讨其信号机制；其次探讨经过温敏分子修饰的水凝胶对伤口愈合的作用,其可以根据温度的变化呈现不同的状态,低于33℃是其呈液态,高于33℃时呈胶状,根据这一特性,其可以满足不同形态伤口的需求,本研究将为其在创伤愈合的进一步应用提供基础。第一章RhoA-Rock-JNK-cJun信号通路介导Activin B促进皮肤创伤愈合研究背景和目的皮肤创伤愈合包括表皮和真皮的再生,表皮的再生过程中最重要的事件之一是：伤口周围的上皮及附属结构的角质形成细胞迁移至创面,在迁移过程中细胞发生一系列表型的改变；其次是紧随发生的细胞增殖活动,角质形成细胞受到创伤事件中细胞因子或者物理化学信号后通过迁移、增殖形成新生表皮的过程即是皮肤再上皮化(re-epithelialization) 。皮肤创伤修复领域有两大核心问题：一是创面愈合的速度问题,二是创面愈合的质量问题。创面的快速愈合,能减少伤口的感染和减轻增生性瘢痕的形成,因此探索如何能促进伤口周围角质形成细胞的迁移增殖问题是解决伤口愈合的关键之处。我们课题组前期的研究发现在In vitro水平活化素B (Activin B)通过调节角质形成细胞肌动蛋白的重组促进细胞的迁移,这一现象依赖于RhoA-JNK和MEKK1-p38信号通路,这一发现为我们进一步在In vivo水平探索伤口愈合的研究提供基础。Activin B是转化生长因子-β (transforming growth factor β, TGF β)超家族成员,目前Activin B作用于其相应受体而发挥生物学效应,卵泡抑素(follistatin)是activin的拮抗剂,为可溶性蛋白,卵泡抑素可以与Activin B结合,通过抑制activin B与其受体的结合而抑制Activin B的生物学效应。RhoA属于Rho家族成员之一,JNK, p38信号属于丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen activated protein kinases, MAPK)家族成员,是介导细胞生物学应答的重要信号系统,采用高度保守的三级激酶级联传递信号。结合前期研究成果我们提出以下问题：In vivo水平Activin B能否促进角质形成细胞的迁移从而加速创伤的愈合?继而探讨参与皮肤创伤愈合过程相应的信号途径?研究方法1.创伤模型：昆明KM小鼠,背部左侧制作0.5cm × 0.5cm的正方形切口；2.分组：PBS组,Activin B组,Plenti6/v5-EGFP组,Plenti6/v5-EGFP-RhoAL63组;Plenti6/v5-RhoAN19组;Y27632组；Plenti6/v5-EGFP+Activin B组,Plenti6/v5-EGFP-RhoAL63+Activin B组；Plenti6/v5-RhoAN19+Activin B组,Activin B+Y27632组；Activin B+SP600125组；SP600125组；Plenti6/v5-EGFP-RhoAL63+SP600125+Activin B组;Plenti6/v5-EGFP+ SP600125+Activin B组;Activin B+Follistatin组;Follistatin组。3.检测指标：(1)组织形态：术后第3天,5天,7天记录伤口面积,计算伤口愈合率；HE染色观察伤口再上皮化；扫描电镜和透射电镜观察创伤愈合超微结构的变化;(2)信号机制：免疫组化检测BrdU标记伤口周围细胞增殖;Western Blotting和免疫组化检测伤口愈合过程中JNK, Rock, ERK, p38和p-JNK, p-ERK, p-p38, p-cJun蛋白激酶的磷酸化活性。研究结果：1.伤口愈合率：结果发现in vivo水平Activin B显著促进创面的再上皮化,提高伤口愈合(与PBS组相比,F=359.810,P<0.001)；2.组织形态观察：Activin B促进伤口周围的角质形成细胞迁移至伤口部位,术后第3天、第5天Activin B组伤口周围上皮角质形成细胞层数多于PBS组,术后第6天再上皮化已经完成,而且发现毛囊的再生。而PBS组术后第6天伤口部分尚未完成再上皮化；扫描电镜和透射电镜发现：Activin B组术后第3天伤口愈合部位可见再上皮化的新生上皮和沿胶原爬行的大量角质形成细胞,PBS组术后第3天伤口愈合表面部位也可见再上皮化的新生上皮,愈合部位横切面角质形成细胞数量低于Activin B组；术后第5天PBS组基底层细胞间连接比Activin B组细胞间连接紧密,提示Activin B组基底细胞更具有爬行的能力,认为Activin B在in vivo水平上促进角质形成细胞的迁移。3.信号事件：免疫组化BrdU检测发现Activin B促进伤口周围角质形成细胞的增殖；Plenti6/v5-EGFP-RhoA L63可以进一步提高伤口愈合率,免疫组织化学和WB检测发现Activin B促进JNK和cJun的磷酸化活化,以上结果提示RhoA、 JNK和cJun参与Activin B促进伤口愈合这一过程；进一步研究发现Plenti6/v5-EGFP-RhoAN19, Rock抑制剂(Y27632), JNK抑制剂(SP600125)以及Follistatin可以抑制Activin B引起的伤口快速再上皮化和伤口周围角质形成细胞的增殖,以上研究结果说明Activin B促进皮肤创伤愈合这一现象是由RhoA-Rock-JNK-cJun信号通路介导。研究结论Activin B促进伤口周围角质形成细胞迁移增殖完成再上皮化过程,而这一现象是由通过RhoA-Rock-JNK-cJun信号通路介导的。第二章温敏水凝胶促进皮肤伤口愈合研究背景和目的皮肤是人体最大的器官,总重量占体重的5%-15%,总面积为1.5-2平方米,其首要功能是将机体组织隔绝外界环境起到保护屏障的作用。同时,由于创伤、烧伤、感染、肿瘤和代谢疾病等造成的皮肤损伤在临床上十分常见。治疗皮肤缺损的关键是使创面尽早封闭,减少机体消耗和内环境紊乱,以及微生物入侵等并发症的发生。对于较大的伤口创面不能尽快实现封闭和自体快速愈合,因此生物材料支架以及生物材料支架复合细胞因子和种子细胞得以应用。目前应用较多的是各种预成型支架材料和水凝胶,相对于预成型支架材料,水凝胶具有很多优点：初始的溶胶／细胞悬液可填充任意形状的缺损,且能与各种治疗药物混合,植入时不需外科手术。因此原位形成凝胶在组织工程中有广泛的应用前景。水凝胶材料可以依据其修饰分子的不同分不同的类型,温敏水凝胶是具有对温度敏感的水凝胶,其具有最低临界共溶温度(Lower critical solution temperature, LCST),在LCST附近体积会突然收缩或膨胀,即发生溶胶相到收缩相的体积转变,即(液态和固态的转化)。本研究将对经过特殊修饰的温敏水凝胶(加拿大曼尼托巴大学邢孟秋教授提供)首先在小鼠创伤模型上探讨修饰后的温敏水凝胶其对伤口愈合过程的作用。伤口愈合过程中主要的生物学事件：炎症反应(主要巨噬细胞)、肉芽组织增生(血管新生,成纤维细胞增殖)、角质形成细胞的增殖和迁移、收口收缩和胶原的产生和降解等,本研究针对以上生物学事件研究温敏水凝胶的作用。研究方法1.创伤模型：C57BL/6小鼠,背部左侧制作lcm× 1cm的正方形切口；2.分组：Control组,Hydrogel-3组,Hydrogel-1组;3.检测指标：(1)组织形态：术后第0-7天,记录伤口面积,计算伤口愈合率；HE染色观察伤口再上皮化；(2)巨噬细胞浸润：术后第3天和第5天取材,石蜡切片,免疫组化检测巨噬细胞标记物F4/80的表达,并进行统计分析；(3)肉芽组织内周细胞的数量：术后第3天和第5天取材,石蜡切片,免疫组化检测周细胞标记物α-SMA的表达,并进行统计分析；(4)肉芽组织内肌成纤维细胞的数量：术后第3天和第5天取材,石蜡切片,免疫组化检测肌成纤维细胞标记物α-SMA的表达,并进行统计分析；(5)角质形成细胞的增殖：术后第3天和第5天取材,石蜡切片,免疫组化检测角质形成细胞的进入增殖状态标记物K6的表达,并进行统计分析；(6)胶原的染色：术后第5天、第7天和第14天取材,石蜡切片,Masson三色染色检测伤口部位胶原的表达。研究结果：1.创伤愈合率：结果发现温敏水凝胶显著提高伤口愈合率(与PBS组相比,F=316.230,P<0.001);2.组织形态观察：在光镜水平观察伤口再上皮化过程,术后第3天,第5天和第7天分别取伤口周围0.5cm范围内的组织,H&E染色发现术后第3天Hydrogel-3和Hydrogel-1组伤口边缘角质形成细胞增殖明显且已经开始向伤口中心迁移形成上皮带(即再上皮化),Control组仅在伤口周围出现角质形成细胞反应增殖,迁移形成上皮带并不明显。术后第5天Hydrogel-3和Hydrogel-1组伤口周围角质形成细胞增殖形成细胞层数更多,迁移速度即(再上皮化速度)快于Control组,术后第7天Hydrogel-1组伤口已经完成再上皮化,Hydrogel-3组伤口部位大部分已经完成再上皮化,该结果提示Hydrogel促进伤口收缩的同时促进伤口再上皮化。3.检测指标：(1)巨噬细胞浸润：术后第3天和第5天取材,石蜡切片,免疫组化检测发现Hydrogel促进巨噬细胞的浸润；(2)肉芽组织内周细胞的数量：术后第3天和第5天取材,石蜡切片,免疫组化检测发现Hydrogel促进周细胞的产生；(3)肉芽组织内肌成纤维细胞的数量：术后第3天和第5天取材,石蜡切片,免疫组化检测发现Hydrogel组肌成纤维细胞数量较Control组多(F=190.303,P<0.001),提示：Hydrogel可通过肌成纤维细胞促进伤口的收缩；(4)角质形成细胞的增殖：术后第3天和第5天取材,石蜡切片,免疫组化检测发现Hydrogel促进角质形成细胞的增殖和迁移；(5)胶原的染色：术后第5天、第7天和第14天取材,石蜡切片,Masson三色染色检测发现Hydrogel促进胶原的生成和降解。研究结论温敏水凝胶调节创伤过程中炎症反应促进伤口收缩进而促进伤口的快速再上皮化。