【摘 要】
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癫痫是中枢神经系统最常见的疾病之一,影响着全球近5000万人。我国现有约1千万癫痫患者,其经过有效治疗后表现通常可以得到缓解甚至消失,但仍有部分癫痫患者因病理生理发生改变难以解决,进而对患者的身体和心理带来不可预知的危害。因此寻求癫痫发病的分子机制是我们现在所面临的严峻问题。神经元限制性沉默因子（REST/NRSF）是神经元表型的主要转录抑制因子,在许多神经系统疾病中进行动态调节,如癫痫、全脑缺血
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癫痫是中枢神经系统最常见的疾病之一,影响着全球近5000万人。我国现有约1千万癫痫患者,其经过有效治疗后表现通常可以得到缓解甚至消失,但仍有部分癫痫患者因病理生理发生改变难以解决,进而对患者的身体和心理带来不可预知的危害。因此寻求癫痫发病的分子机制是我们现在所面临的严峻问题。神经元限制性沉默因子（REST/NRSF）是神经元表型的主要转录抑制因子,在许多神经系统疾病中进行动态调节,如癫痫、全脑缺血、亨廷顿病、帕金森病和唐氏综合症,其在神经系统的生长和发育中发挥重要的作用。越来越多的证据表明癫痫中神经元特异性基因的表达受REST/NRSF的调控,本论文利用RESTloxp/loxp转基因小鼠探讨海马神经元中REST/NRSF在癫痫发生发展中作用。论文将从四个方面进行探究:一、观察临床患者癫痫病灶中REST/NRSF表达水平;二、观察小鼠海人藻酸癫痫模型海马组织中REST/NRSF表达水平;三、观察小鼠海马脑区特异性敲除REST/NRSF对海人藻酸致癫痫的影响;四、观察小鼠海马脑区特异性过表达REST/NRSF对海人藻酸致癫痫的影响。目的:探究REST/NRSF在调控癫痫疾病中的作用及作用机制。方法:1、采用免疫组织化学染色技术检测临床患者癫痫灶组织和脑外伤手术切除正常脑组织REST/NRSF表达水平。2、建立海人藻酸癫痫模型,采用免疫组织化学染色、Western-blot、q PCR技术检测海人藻酸腹腔注射后第1天,3天,7天,14天小鼠海马组织REST/NRSF表达水平。3、利用腺相关病毒于小鼠双侧海马CA1脑区敲低或过表达REST/NRSF,给予病毒28天后进行海人藻酸致癫痫脑电图分析和行为学测试。结果:1、收集临床患者癫痫灶组织和脑外伤手术切除正常脑组织样本进行免疫组化染色,结果显示癫痫患者癫痫灶组织REST/NRSF表达水平显著高于脑外伤手术切除正常脑组织。2、成功建立海人藻酸癫痫模型,免疫组织化学染色、Western-blot结果显示注射海人藻酸后第1天癫痫组小鼠与注射生理盐水组小鼠海马脑区中REST/NRSF的蛋白表达水平没有明显差异,注射海人藻酸后第3天,第7天,第14天癫痫组小鼠与注射生理盐水组小鼠海马脑区中相比REST/NRSF的蛋白表达水平显著升高;RT-PCR技术结果显示注射海人藻酸后第1天癫痫组小鼠与注射生理盐水组小鼠海马脑区中REST/NRSF的m RNA表达水平没有明显差异,注射海人藻酸后第3天,第7天,第14天癫痫组小鼠与注射生理盐水组小鼠海马脑区中相比REST/NRSF的m RNA表达水平显著升高,同时伴随Kv7.2和Kv7.3通道等多种离子通道表达水平显著降低。3、海马CA1脑区注射病毒第28天脑电图与行为学结果显示,AAV-Cre-GFP病毒组小鼠与AAV-Null病毒组小鼠相比能够显著降低脑电图高电位的棘波、尖波发放频率;降低小鼠癫痫最大发作等级、发作次数、癫痫持续发作时间以及癫痫发作总时间,增加癫痫最大发作潜伏期。4、海马CA1脑区注射病毒第28天行为学与脑电图结果显示,AAV-REST-myc病毒组小鼠与AAV-Null病毒组小鼠相比能够显著增加脑电图高电位的棘波、尖波发放频率;增加小鼠癫痫最大发作等级、发作次数、癫痫持续发作时间以及癫痫发作总时间,降低癫痫最大发作潜伏期。结论:1、小鼠海马脑区REST/NRSF升高导致Kv7.2、Kv7.3等钾通道表达水平降低可能在海人藻酸致癫痫发作中发挥重要作用。
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