论文部分内容阅读
血管内皮细胞（EC）指血管内表面形成的单层扁平细胞，它们在多种生理过程中发挥着重要的作用。猪的血管内皮细胞是猪瘟病毒（CSFV）的主要靶细胞，其感染CFSV后可引起严重的广泛性出血，是导致病猪死亡的主要原因之一。因此EC是研究CSFV感染及致病机制的良好细胞模型。原代EC作为一种终末分化的细胞，在体外的培养时间有限，传代10次左右就会进入衰老期而不能再继续增殖。反复分离原代EC不仅费时费力，而且各批次细胞间存在差异，不能保持各种细胞生理指标的稳定性。为了在CSFV感染与致病机制的研究过程中拥有稳定的、充足的细胞材料，我们拟建立能在体外无限培养的永生化猪EC细胞系。本研究首先采集新生小猪脐带，分离出静脉血管，灌注0.1%的I型胶原酶溶液，在37℃水浴消化10min后收集并培养血管内皮细胞。从共计200多条脐静脉中分离获得了大量的猪脐静脉血管内皮细胞（SUVEC）。这些细胞呈单层铺路石样排列生长，2～3d能长满单层，von Willbrand factor阳性，并能大量摄取Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白（Dil-Ac-LDL），证明这些细胞为血管内皮细胞。前2～6代的SUVEC生长速度较快，可用于CSFV感染研究，之后细胞生长速度逐渐减慢，总共可培养10代左右。为了提高基因重组效率，本研究使用重组逆转录病毒介导的基因转导来将人端粒酶催化亚基（hTERT）基因或SV40大T抗原（SV40LT）基因分别转移进入SUVEC中。重组逆转录病毒载体pBABE-neo-hTERT和pBABE-puro-SV40LT分别与pVSV-G质粒共转染到GP2-293细胞中，收集假病毒液并感染SUVEC，利用G418或嘌呤霉素筛选出阳性克隆，并进行传代研究和细胞形态学及表型鉴定。获得的两个稳定的猪血管内皮细胞系分别命名为SUVEC-hT（携带hTERT基因）和SUVEC-ST（携带SV40LT基因）。两种细胞系均呈铺路石样单层排列生长，具有高度的增殖活性，生长速度比原代血管内皮细胞快，能稳定地传代培养而不表现衰老细胞的特征，迄今已培养至第120代和第115代，细胞生长仍然稳定，形态正常。利用RT-PCR及Western Blotting检测到SUVEC-hT细胞系持续表达hTERT，SUVEC-ST细胞系持续表达SV40T抗原。SUVEC-hT细胞还表达特异的内皮细胞标志CD31、CD34和von Willebrand factor，并能摄取Dil-Ac-LDL。SUVEC-ST细胞系持续表达CD31和CD34分子，并能摄取Dil-Ac-LDL。核型分析表明，两种细胞系均保持与SUVEC相同的染色体数目和形态，含有38条染色体及正常的核型。细胞保持贴壁依赖性、接触抑制性，并且不能在软琼脂中生长。细胞增殖能力研究表明，这两个细胞系保持血清依赖性，它们不能在无血清培养基中生长；细胞增殖速度随着血清浓度的增加而加快，在血清浓度为10%时达到最大值，更高的血清浓度及内皮细胞生长支持物对细胞的生长没有进一步的促进作用。CSFV感染结果表明，两个细胞系保持了对CSFV的敏感性。以上研究表明，本研究在成功分离培养SUVEC的基础上，通过转录病毒转导的方法利用hTERT或SV40LT基因成功地建立了永生化的猪血管内皮细胞系SUVEC-hT及SUVEC-ST。它们保留了EC的主要生物学特征，并且是正常的而非转化的细胞。这些细胞将有助于出血性疾病病毒如CSFV的致病机理研究。