创伤性脑损伤(traumaitc brain injury, TBI),简称颅脑外伤,是神经外科领域常见的急症之一,目前已成为全世界35岁以下青壮年人群死亡和致残的第一位原因(http://www.dc.gov/traumaticbraininjury/statistics.html#3)。随着我国国民经济和交通运输业等发展,我国颅脑外伤病例也呈上升趋势,其中百分之七八十是由交通事故造成,另一个主要原因是工伤意外。目前医学界对颅脑外伤的整体研究尚不深入,也不够完善,颅脑外伤的基础研究和临床防治应用研究还很薄弱。目前临床上尚无一种确切的药物对脑损伤肯定有效。本论文分别观测了食物补充OMEGA-3(co-3)多不饱和脂肪酸以及NKCC1抑制对小鼠颅脑外伤的神经保护作用。一. 食物补充 ω-3多不饱和脂肪酸(omega-3 polyunsaturated fatty acid,ω-3 PUFAs)对小鼠颅脑外伤的神经保护作用。ω-3 PUFAs作为一类重要的不饱和脂肪酸,在脑内含量极为丰富,主要分布于神经元细胞膜特别是神经突触前膜上,并且对于维持脑的解剖结构,生化和生理功能的完整性具有极为重要的作用。以往的研究结果显示,作为ω-3 PUFA s在成年小鼠创伤性脑损伤中具有显著的神经保护作用,其作用机制涉及抗凋亡,抗炎症,抑制氧化应激反应,促进神经营养因子分泌,减轻神经兴奋毒性,促进神经细胞再生等；后来,James D等人提出ω-3 PUFAs对颅脑外伤后白质损伤极有可能具有保护作用[1]。因此,我们的研究主要目的是：证实ω-3 PUFAs在创伤性脑损伤中的作用,并深入探究ω-3 PUFAs的白质损伤修复的保护机制。我们将实验小鼠随机分为假手术组(sham),对照组(CCI),干预组(ω-3 CCI)。采用肌力测试、前肢不对称测试以及错步实验来评测短期和长期运动功能,利用水迷宫测试高级认知功能(学习,记忆能力)。焦油紫染色用来分析计算损伤体积和计算海马CA3区存活神经元数量。Ibal/CD86/CD206免疫组织化学染色来观察颅脑外伤后小胶质细胞的激活情况以及M1期,M2期小胶质细胞的分布情况。MBP/SMI32免疫组织化学染色、western blot、电镜观察TBI后损伤周边区胼胝体超微结构、电生理检测TBI后损伤周边区胼胝体的动作电位传导能力等方法来分析颅脑外伤后白质损伤修复情况。同时为了探讨神经保护机制,我们进行体外实验来研究具体的作用机制。研究结果显示：ω-3 PUFAs虽然不能减少小鼠颅脑外伤后的组织缺失,但却能明显改善损伤后长期的小鼠神经行为学表现,提高学习、记忆能力。进一步研究发现,ω-3 PUFAs组显著减少损伤后海马CA3区神经元丢失、抑制损伤后的小胶质细胞的过度激活、减轻外伤后损伤周边区的髓鞘脱失,尤其改善损伤周边区胼胝体动作电位的传导。体外实验中,一方面,DHA预处理后的少突胶质细胞明显减轻AMPA诱导的退行性变,提高了存活率；另一方面,DHA预处理后的小胶质细胞和少突胶质细胞共培养时,明显减轻AM PA诱导的少突胶质细胞退行性变,提高了存活率。结果表明,ω-3 PUFAs家族中的主成员DHA可以通过直接和间接的方式来减轻AMPA对少突胶质细胞的损害。总之,本研究显示,ω-3 PUFAs能明显改善颅脑外伤造成的神经功能缺失,同时能明显减轻海马神经元变性坏死,增强学习记忆功能。本实验为临床运用co-3PUFAs防治颅脑外伤,促进神经功能恢复,提供了重要的实验依据。二.NKCC1抑制(抑制剂Bumetanide或NKCC1敲除)对小鼠颅脑外伤的神经保护作用：钠-钾-氯共转运体(Na+-K+-2Cl--cotransporter,NKCC)是一类分布广泛的离子转运载体,包括NKCC1和NKCC2两种亚型。NKCC1是CNS内唯一的NKCC蛋白,表达在微血管内皮细胞、星形胶质细胞和神经元的胞体细胞膜和轴突上,是维持BBB选择性离子通透性、保持星形胶质细胞和神经元细胞内正常离子浓度及细胞容积,发挥正常功能的结构基础。NKCC2主要分布在肾脏髓袢升支粗段的上皮细胞,参与全身水和电解质的代谢[2]。目前研究发现,NKCC1主要表达在神经胶质细胞和神经元中,但是关于其在TBI中发挥脑保护作用的研究较少[3-5]。本实验通过研究小鼠在TBI后,抑制NKCC1对小鼠脑含水量和神经功能改变的影响,以及可能通过保护血脑屏障和促进白质损伤修复而发挥脑保护作用的机制,为NKCC1抑制剂-布美他尼(bumetanide)可能成为潜在的脑保护剂提供实验基础和理论依据。我们随机将野生型实验小鼠分为假手术组(sham),对照组(vehicle),干预组(Bumetani de),同时我们采用NKCC1敲除小鼠进一步确认NKCC1在颅颅脑外伤中的作用,将基因敲除小鼠分为NKCC1+/+段手术组(NKCC1+/+ sham),NKCC1+/+假手术组(NKCC1+/-sham),NKCC1+/+手术组(NKCC1+/+CCI),NKCC1+/-手术组(NKCC1+/-CCI)。采用肌力测试、前肢不对称测试以及错步实验来评测短期和长期感觉运动功能。焦油紫染色测定脑缺损体积。伊文斯蓝注入测量其通过血脑屏障通透性并采用免疫组织化学和、western blot分析其紧密连接蛋白、分析脑水肿；同时用电镜观察各处理组的血脑屏障超微结构的破坏情况。MBP/SMI32免疫组织化学染色、western blot、电镜观察TBI周边区胼胝体超微结构、电生理检测TBI周边区胼胝体的动作电位传导能力等方法来分析颅脑外伤后白质损伤修复情况。研究结果显示：Bumetani de虽然不能减少小鼠颅脑外伤后的组织缺失,但却能明显改善损伤后长期的小鼠神经行为学表现；抑制神经元和星形胶质细胞中MMP9的表达和活性,减轻其对血脑屏障紧密连接蛋白的降解,进而减轻损伤周边区血脑屏障的破坏,保持血脑屏障正常的通透性；抑制外伤后损伤周边区的髓鞘脱失和轴突损伤,促进髓鞘相关蛋白的合成,改善损伤周边区胼胝体动作电位的传导,促进白质损伤修复；上述保护作用在转基因小鼠身上也得到验证：相对于NKCC1+/+(野生型)小鼠,NKCC1+/-(NKCC1杂合子型)的小鼠在脑中风后感觉运动功能明显好转,IgG的渗出明显减少,白质损伤修复明显增强。总之,本研究显示,NKCCl抑制能明显改善颅脑外伤后的神经行为学表现,促进神经功能的恢复。本实验为临床运用Bumetanide防治颅脑外伤,促进神经功能恢复,提供了重要的实验依据。