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研究目的：1从氧化应激入手,采用体外培养的大鼠原代细胞和心肌细胞系,揭示益心解毒方改善心功能、延缓心室重构的主要作用环节。2从介导心衰氧化应激的关键酶一NADPH氧化酶的主要亚型NOX2、NOX4亚基入手,从转录、翻译及翻译后层面,深入阐释益心解毒方抑制NADPH氧化酶活性的主要效应环节与机制。3通过检测氧化应激通路细胞信号转导的相关分子的变化,探讨NOX2、NOX4基因对心衰大鼠心肌细胞的保护作用的分子信号机制。4为研发新的、可用于临床冠心病心衰防治的、低毒、高效的活性氧(ROS)抑制剂提供可用的实验依据。研究方法与内容：1益心解毒方对原代培养的大鼠心肌细胞收缩力的影响：原代心肌细胞的分离、培养,制备益心解毒方含药血清及空白血清。采用AngⅡⅡ作为使NADPH氧化酶活化的刺激因素,空白血清和含药血清干预,观察原代心肌细胞搏动情况及测定心肌细胞收缩幅度。2益心解毒方对AngⅡ诱导的H9c2细胞NADPH氧化酶表达作用机制的研究：体外培养H9c2大鼠心肌细胞,以细胞密度1×105个/mL接种于培养板或平皿中,待细胞长至孔底85%-90%,选择生长状态良好的细胞,转入无血清的培养基中同步化24h进行实验。乙酰乙酸双氯荧光素(DCFH-DA)法测定心肌细胞内ROS水平,采用蛋白质印迹法和PCR法检测NOX2和NOX4亚基的表达水平。3益心解毒方对NOX2(或NOX4)亚基过表达的H9c2细胞NADPH氧化酶活性的影响：H9c2细胞分别转染空质粒载体(pEGFP-C1)或含有可表达NOX2(或NOX4)亚基开放阅读框的重组质粒载体,建立NOX2(或NOX4)亚基过表达H9c2细胞模型。倒置显微镜下观察转染情况,流式细胞术检测转染效率,蛋白质印迹法验证NOX2(或NOX4)亚基的表达水平。转染后心肌细胞分组给予不同的药物血清干预,通过NADPH氧化酶活性检测试剂盒检测心肌细胞NADPH氧化酶活性。4益心解毒方对NOX2(或NOX4亚基)RNAi的H9c2细胞NADPH氧化酶活性的影响：设计特异性的NOX2(或NOX4亚基)小干扰RNA转染H9c2细胞,建立NOX2RNAi (或NOX4RNAi)H9c2细胞模型。基因沉默效应采用反转录-实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法筛选,采用沉默效果明显的干扰质粒转染心肌细胞后分组给予不同的药物血清干预,通过NADPH氧化酶活性检测试剂盒检测心肌细胞NADPH氧化酶活性。5益心解毒方对H9c2细胞NOX2(或NOX4亚基)报告基因表达的影响：构建pGL3-NOX2(或pGL3-NOX4)重组质粒并转染H9c2细胞,分组给予不同的药物血清干预。实验终点检测报告基因荧光素酶活性,以分析益心解毒方含药血清对NOX2亚基转录的影响。6益心解毒方对氧化应激通路细胞信号转导相关分子的影响：采用Western-blot法检测各组H9c2心肌细胞信号转导通路相关分子AT1.p22phox、p47phox、MMP3、STAT3、MMP9的变化。研究结果：1在给予Ang Ⅱ刺激24h后,模型组心肌细胞搏动频率较正常对照组下降,与模型组相比,益心解毒方含药血清各剂量组能提高AngⅡ引起的心肌细胞搏动频率的下降。与AngⅡ组相比,含药血清高剂量组作用明显(P<0.05)；益心解毒方含药血清高、低剂量组可改善心肌细胞搏动幅度(P>0.05)。2与AngⅡ模型组相比,益心解毒方含药血清各剂量组能明显抑制AngⅡ引起的细胞内ROS水平的升高,其中小剂量组最为显著,差异有统计学意义(P<0.05)；含药血清各剂量组NOX2和NOX4亚基mRNA表达量明显低于模型组,与模型组相比,NOX2亚基mRNA表达量的中、低剂量组和DPI对照组差异有统计学意义(P<0.05；P<0.01)；益心解毒方各剂量组对AngⅡ引起的H9c2心肌细胞中NOX2和NOX4蛋白表达较模型组减少,对结果进行统计显示：低剂量组NOX2和NOX4亚基表达条带的光密度比值低于模型组,差异有统计学意义(P<0.01；P<0.05)。mRNA和蛋白水平的变化具有较好的一致性,益心解毒方对其表达水平的调控可能以转录水平的调控为主。3成功构建NOX2和NOX4亚基过表达质粒和过表达的H9c2细胞模型,观察益心解毒方含药血清对NOX2(或NOX4)过表达的H9c2细胞NADPH氧化酶活性影响。结果表明：在NOX2过表达体系中,益心解毒方中、低剂量组NADPH氧化酶活性显著降低(P<0.01)；在NOX4过表达体系中,益心解毒方中剂量组NADPH氧化酶活性显著降低(P<0.05)。进一步证明益心解毒方含药血清对NADPH氧化酶活化环节具有调控作用,且对于NOX2型NADPH氧化酶活化的调控作用最为显著。这与NOX2的调控特征有关系。4成功构建了NOX2(或NOX4)亚基小干扰RNA表达质粒和H9c2心肌细胞NOX2、OX4亚基RNAi模型,观察益心解毒方含药血清对此细胞模型的NADPH氧化酶活性影响。结果表明：NOX2(或NOX4)亚基RNA沉默后,心肌细胞NADPH氧化酶活性均显著降低,提示NOX2和NOX4型均是心肌细胞NADPH氧化酶的主要亚型,而抑制4NOX2和NOX4型NADPH氧化酶均是益心解毒方的作用环节。5成功克隆了NOX2(或NOX4)的启动子片段,构建NOX2(或NOX4)报告基因表达载体和H9c2心肌细胞NOX2、NOX4亚基报告基因表达模型,观察了益心解毒方含药血清对NOX2(或NOX4)报告基因表达的H9c2细胞NADPH氧化酶活性影响。结果表明：本研究通过真核细胞瞬时转染技术,发现在H9c2细胞中,NOX2(或NOX4)启动子片段均有活性,经过AngⅡ刺激后,NOX2(或NOX4)报告基因相对表达量明显增加,即AngⅡ可使这两个基因的转录表达载体活性增加。在益心解毒方作用下,NOX4报告基因组的荧光素酶表达量与模型组相比,差异有统计学意义(P<0.05；P<0.01)；NOX2报告基因组的荧光素酶相对表达水平与模型组相比,差异无统计学意义,说明该方对NOX4基因的转录水平调控较NOX2基因更为明显。因此益心解毒方是通过干预NOX2和NOX4基因的转录水平调控NADPH氧化酶活性。6通过检测氧化应激通路上下游关键蛋白：AT1受体、STAT3、MMP9、MMP3、p22phox、 p47phox蛋白表达发现：益心解毒方含药血清高、中、低剂量组对AngⅡ引起的H9c2心肌细胞中6个蛋白表达水平较模型组降低,对结果进行统计显示：低剂量组、DPI对照组、6个蛋白表达水平均低于模型组,差异有统计学意义(P<0.01；P<0.05)；中、高剂量组STAT3、MMP3、p47phox、p22phox蛋白表达水平均低于模型组,差异有统计学意义(P<0.01; P<0.05)。p22phox、p47phox蛋白表达变化提示益心解毒方对于NADPH氧化酶复合物形成及酶活化的环节具有调控作用；降低AT1受体的表达水平,发挥其在心肌肥厚过程中的心肌保护作用；抑制STAT3蛋白的表达,延缓心肌肥厚的过程；同时降低MMPs的活性,抑制心肌重塑而保护心肌细胞。该方可能通过调控NADPH氧化酶活性,发挥抑制心肌细胞肥大、心肌纤维化起到保护心肌细胞的作用,延缓心衰的进程。结论：益心解毒方主要作用于NOX2和NOX4型NADPH氧化酶,可能的作用环节包括：1通过原代心肌细胞实验结果证实该复方可以增强心肌细胞的收缩力,提高心肌的收缩幅度和频率,结合前期的动物实验研究,该方在改善血循环,减少心肌的耗氧量,调节心脏能量代谢方面药效明显。2在H9c2细胞中,Ang Ⅱ能够激活NADPH氧化酶,产生ROS,导致细胞氧化应激反应,而通过调控NOX2和NOX4亚型的NADPH氧化酶活性,降低心肌ROS水平可能是益心解毒方发挥药效的重要机制之一。3通过观察益心解毒方含药血清对NOX2(或NOX4)过表达的H9C2细胞NADPH氧化酶活性影响,发现益心解毒方在NOX2过表达的体系中,可能是通过抑制NOX4亚基表达起作用的；在NOX4过表达的体系中,可能是通过抑制NOX2亚基表达起作用。益心解毒方可以降低NOX2或NOX4亚基过表达模型的NADPH氧化酶的活性,揭示其作用环节是干预NOX2或NOX4亚型的NADPH氧化酶基因翻译后水平调控环节有关,抑制NADPH氧化酶基因表达是降低NADPH氧化酶活性的另一条途径。4通过观察益心解毒方含药血清对NOX2(或NOX4)亚基RNA干扰的H9C2细胞模型NADPH氧化酶活性的影响,发现：NOX2(或NOX4)亚基的RNA沉默后,心肌细胞NADPH氧化酶活性均显著降低。提示NOX2和NOX4型均是心肌细胞NADPH氧化酶的主要亚型,而抑制NOX2和NOX4型NADPH氧化酶翻译水平的表达是益心解毒方的作用环节。5通过真核细胞瞬时转染技术,发现在H9c2细胞中,NOX2(或NOX4)启动子片段均有活性,经过AngⅡ刺激后,NOX2(或NOX4)报告基因相对表达量明显增加,即AngⅡ可使这两个基因的转录表达载体活性增加。在益心解毒方的作用下有所降低,因此益心解毒方是通过干预NOX2和NOX4基因的转录水平调控NADPH氧化酶活性。6益心解毒方可通过多个效应成分、作用于NADPH氧化酶活性调控的多个环节发挥整合效应,表现为对上游信号转导通路、转录、翻译及翻译后修饰等多个环节的调控作用的综合效应。这些多环节的作用必然涉及到多个效应成分,也可能涉及到NADPH氧化酶调控网络的多个作用靶点。通过降低跨膜亚基p22phox和活化亚基p47phox的表达,调节NADPH氧化酶的组装、活化；降低AT1受体含量,抑制AngⅡ诱导的NOX2或NOX4表达水平增加;通过调控NADPH氧化酶活性,降低下游MMP3、MMP9、STAT3蛋白的表达水平,进而抑制心室重构,发挥保护心肌作用。