研究背景腭裂是常见的先天性颅颜出生缺陷,源于腭在发育过程中受到环境因素和遗传因素及其相互作用的干扰,众多因素精确调节着继发腭的发育过程,但是直至今日腭裂的发病机制仍不清楚。由于腭裂的高发病率以及会造成患者、患者的家庭及社会严重的健康和经济负担,因此分析腭裂的病因及分子病理机制是势在必行的。鼠和人类的胚胎发育过程中有相似的颅面形态结构和特征,因此鼠是研究腭发生过程及腭裂的绝佳模型。糖皮质激素是一种常见并常用的免疫抑制剂,在胚胎发育的早期糖皮质激素维持正常的生理水平对颅面发育有着至关重要的作用,但是高剂量的外源性的糖皮质激素对胚胎的发育却是及其有害。1954年Fraser及其同事成功地通过可的松(糖皮质激素中的一种)诱导了A/J孕鼠的胚胎发生100%的腭裂,并观察到可的松可以延迟腭突的抬高并且诱导小腭突的生成,由于这样的干扰从而影响腭突的接触和融合过程。Pinsky和Digeorge使用氢化可的松、强的松龙及地塞米松(均为糖皮质激素)诱导A/J孕鼠胚胎腭裂发生时发现地塞米松比氢化可的松的致畸率高300倍并且未见其他畸形发生,说明地塞米松是一种诱导腭裂发生的良好环境刺激因素。最近有研究发现地塞米松可以通过抑制Wnt蛋白信号和诱导细胞凋亡从而引起骨质疏松的发生,而且地塞米松诱导的骨细胞凋亡还可以被Wnt信号分子的表达而拯救。维甲酸,维生素A的衍生物,在人类胚胎的发育过程中有着重要的作用,主要调节着胚胎的形态学发育,对细胞的增殖、分化以及细胞外基质的生成有着重要影响。过量的外源性的维甲酸对颅面的发育不管在人类还是鼠类都有极其有害的影响。对于维甲酸诱导的孕鼠来说,胚胎形成腭裂是一种主要的形态学畸形。维甲酸对小鼠种系不具有致畸敏感性,也就是维甲酸对所有小鼠都可以高效的诱导腭裂发生。因此,维甲酸是一种理想的诱导腭裂发生的环境因素。最近几年有文献表明在器官的发育与疾病的治疗上维甲酸与Wnt信号通路分子有着重要的联系。部分腭裂畸形源于敏感系孕鼠暴露于致畸因子或环境污染因素如二噁英。有文献报道孕鼠暴露于二噁英胚胎将会出现高发病率的腭裂和肾脏疾病,但却没有其他畸形或者并发症发生。同时也有大量文献报道二噁英与Wnt信号通路之间存在相互作用。然而,目前并没有二嗯英诱导腭裂与Wnt相关的研究报道,并且二噁英诱导腭裂发生的详细机制仍不清楚。尽管在唇腭裂发生病因学研究的基因组学广泛联系研究中并没有涉及到WNT基因,但是WNT基因的变异与唇腭裂有显著关系已被确切证明。有大量研究报道在人类及鼠Wnt3及Wnt9b基因的突变均与唇腭裂的发生相关,因此Wnt信号通路在颅颜的发育中有着重要作用是肯定的。有研究表明WNT3的突变与伴随有唇腭裂发生的自发性常染色体隐性遗传相关。这些研究结果使我们想更详细的分析WNT信号通路中的基因情况,因为WNT早已被认作唇腭裂发病的候选基因。Wnt信号通路在胚胎早期的发育过程中起着重要作用并且在唇与腭都有大量表达。Wnt配体至少可以激活3个信号通路：Wnt/β-catenin经典信号通路、不依赖β-catenin的非经典信号通路或称Vnt/Ca2+信号通路,该信号通路中蛋白激酶A是一个重要的元素以及细胞极性信号通路。有研究表明Wnt3A、Wnt5A和Wntl1与非综合征唇腭裂有显著地相关性,这些Wnt信号分子作为重要且特别的配体信号去激活细胞内信号分子,诱导细胞发生多种生物学变化如细胞增殖、迁移、生长、分化及凋亡等。研究目的本研究通过检测在腭发育的关键时期(E13.5到E15.5)地塞米松、维甲酸和二嗯英三种环境因素诱导孕鼠后是否改变Wnt信号通路分子的表达以及细胞命运(细胞增殖与细胞凋亡)从而形成腭裂来阐明三种环境因素诱导腭裂的发病机理。材料与方法(一一)动物我们将性成熟的昆明母鼠与可以交配的雄鼠(来源于南方医科大学实验动物中心)以3：1的比例合笼过夜。隔日早晨检查到阴道栓的母鼠单独放置记为E0.5。当E8.5时随机将孕鼠分为两组,一组给予每天8mg/kg的地塞米松(MP Biomedicals, OH, USA),司隔12小时分为2次皮下注射给药,每次给予4mg/kg。另一组以相同给药方式给予10ml/kg的生理盐水,该组作为对照组。从E8.5一直给药到E13.5。在E12时我们随机将孕鼠分为两组,一组给予70mg/kg的维甲酸(Sigma, MO, USA),维甲酸溶解于二甲基亚砜后混合芝麻油通过灌胃的方式作用于孕鼠。另一组给予10ml/kg的芝麻油-DMSO,该组作为对照组。在E12时我们随机将孕鼠分为两组,一组给予64μg/kg的二嗯英(Cerilliant, MA, USA),二噁英溶解于二甲基亚砜后混合芝麻油通过灌胃的方式作用于孕鼠。另一组给予10ml/kg的芝麻油+DMSO,该组作为对照组。之后我们取E13.5、E14.5、E15.5和E17.5的胚胎做后续实验分析及检测。(二)扫描电镜E17.5取下的胚胎行扫描电镜检测。修剪E17.5胚胎(包括地塞米松对照组和地塞米松处理组、维甲酸对照组和维甲酸处理组、二嗯英对照组和二嗯英处理组)后用放入2.5%的戊二醛中4摄氏度固定12个小时；后用逐级增高浓度的丙酮溶液脱水;将经过上述处理的样本放于液态二氧化碳中充分干燥后包被一层金。最后S-3000N扫描电镜仪上机观察。(三)组织染色首先我们将地塞米松对照组和地塞米松处理组、维甲酸对照组和维甲酸处理组、二噁英对照组和二噁英处理组的胚胎进行制片处理。剪下胚胎的头部放于4%多聚甲醛中固定。常规包埋和切片(切片厚度为5μm)后行HE染色。(四)Western blot分析首先我们提取从E13.5到E15.5地塞米松对照组和地塞米松处理组、维甲酸对照组和维甲酸处理组、二噁英对照组和二噁英处理组的胚胎的腭突及舌组织蛋白。接着我们用标准的Western步骤分析Wnt3a、Wnt5a和Wntll(all R&D Systems,MN,USA)；Gsk-3β、β-catenin和Lef-1(all Cell Signaliling,MA,USA)； c-Jun和phosphho-c-Jun(pS63；both Epitomnics,Hangzhou,China)和α-Tubulin(Santa Cruz Biotechnology,CA,USA)的蛋白表达。(五)BrdU分析首先我们将E13.5、E14.5及E15.5孕鼠按1ml/100g的量腹腔注射BrdU(5-bromo-2’-deoxyuridine；Invitrogen,CA,USA).2小时后,取出胚胎,剪下胚胎的头部(包括地塞米松对照组和地塞米松处理组、维甲酸对照组和维甲酸处理组、二噁英对照组和二噁英处理组)放于4%多聚甲醛中固定。切片用2个单位的HCl+0.5％Triton,37摄氏度水浴1小时后接着我们用BrdU抗体(AlexaFluor(?)555标记的荧光抗体)室温孵育。(六)TUNEL我们通过TUNEL检测地塞米松对照组和地塞米松处理组、维甲酸对照组和维甲酸处理组、二噁英对照组和二噁英处理组的胚胎颅颜组织从E13.5到E15.5凋亡细胞的数量。使用的是FragELTM DNA末端检测试剂盒,绿色荧光标记(Calbiochem, Darmstadt, Germany)凋亡细胞。(七)统计学分析所有的资料均使用两独立样本t检验来分析。应用统计学软件SPSS13.0进行统计学检验,结果p<0.05表示差别有统计学意义。每个实验至少完成3次。结果(一)地塞米松诱导腭裂A.地塞米松处理组的胚胎展示腭裂我们选用从E8.5到E13.5每日用8mg/kg的地塞米松,每日两次,间隔12小时一次,每次4mg/kg作为地塞米松诱导腭裂病理机制检测分析的作用浓度及时间。在这样的作用浓度和时问可以检测到地塞米松作用后E17.5孕鼠胚胎有82%腭裂发生率,而相同条件下对照组的孕鼠胚胎并没有发现腭裂发生。地塞米松处理的腭突已经上抬,但是却没有接触、粘附及融合。在E13.5,地塞米松处理胚胎的前面区域的腭突同对照组相同区域的腭突相比具有相似性。E14.5地塞米松诱导的腭突仍同E13.5一样均垂直向下生长。在E15.5地塞米松处理胚胎的腭突绝大部分均已经抬高,甚至有部分已经接触和粘连,但没有融合。然而,对照组的腭突不仅接触粘连而且开始融合。在E17.5时最终显示一个大裂隙,呈现腭裂的表型特征；而对照组的腭突最终发育为完整的继发腭。我们的研究发现地塞米松处理的E14.5胚胎的前后区域腭突的抬高常常是不同步的,有时一边抬高,另一边仍是垂直生长,并且这样的现象在E15.5和E17.5仍可以被发现。B.E13.5到E15.5Wnt/β-catenin信号被地塞米松完全抑制我们用免疫印迹的方法检测了从E13.5到E15.5地塞米松处理组胚胎和对照组胚胎的发育中腭突及舌组织的Wnt信号蛋白表达的情况。地塞米松处理的组织与对照组的组织相比,Gsk-3β蛋白的表达呈现出一种向下的迁移的现象,并且我们检测到地塞米松处理组Wnt/β-catenin信号通路分子整体表达均被下调,如P-catenin、Lef-1、c-Jun和phospho-c-Jun的蛋白表达均被下调,从结果我们可以得出地塞米松完全抑制了发育中的腭突Wnt/β-catenin信号通路。C.地塞米松诱导的腭裂在细胞学机制上与腭突上皮的增殖和凋亡相关E13.5腭突的前面区域和后面区域的中间缘上皮由于地塞米松的处理和对照组相比增殖相对较低。但是在E14.5,地塞米松处理的腭突的前面区域和后面区域的中间缘上皮的增殖和对照组相比却相对较高。在E15.5,地塞米松处理的腭突前面区域和后面区域的中间缘上皮的增殖和对照组相比仍然持续增高。我们检测到E13.5地塞米松处理组胚胎和对照组胚胎在腭突的前面和后面区域的口腔上皮面均有聚集成团的TUNEL阳性标记细胞。然而在E14.5,地塞米松处理组胚胎仍可在未上抬腭突的前面区域的口腔面上皮检测到TUNEL标记凋亡细胞,但在已经上抬的对照组前面区域腭突却检测不到凋亡细胞的存在。在E15.5对照组胚胎残留的中间上皮脊中我们可以观察到TUNEL阳性染色的凋亡细胞,细胞的凋亡促使着着中间缘上皮的逐渐消失,使左右腭突的间充质细胞相连接形成继发腭。但是,重要的发现是地塞米松处理组胚胎腭突的中间缘上皮及中间上皮脊均未检测到有凋亡细胞存在。地塞米松处理的胚胎腭突在前面区域和后面区域的口腔底上皮和对照组相同区域相比均没有显示凋亡细胞,而我们在对照组相同区域却检测到了凋亡细胞的存在。但是在E14.5,大量的TUNEL阳性标记的凋亡细胞聚集在地塞米松处理胚胎的口腔底上皮。在E14.5不管是地塞米松处理组胚胎还是对照组胚胎在颅底与左右腭突的连接处都可以看到有大量的TUNEL阳性标记的凋亡细胞存在。(二)维甲酸诱导腭裂A.维甲酸处理的孕鼠胚胎展示了100%腭裂率我们选用70mg/kg的维甲酸在E12作用于昆明孕鼠,胚胎显示了100%腭裂率。和对照组胚胎相比,维甲酸处理孕鼠的E17.5胚胎显示宽泛的完整继发腭的腭裂,从扫描电镜的结果中我们可以观察到维甲酸处理的胚胎的腭突并没有上抬。维甲酸处理的胚胎与对照组的胚胎相比腭突上的褶皱相对较多及较明显。在E13.5维甲酸作用的胚胎显示前面区域的腭突与上颌的交界处没有沟,然而对照组胚胎的相同区域的沟非常明显。所有的E14.5维甲酸处理的胚胎前面区域和后面区域的腭突均是垂直向下生长的。E14.5维甲酸处理的胚胎前面区域在腭突和上颌体相交区域的沟均不能被观察到,而在对照组未上抬的腭突的相同区域可以见到这样的沟存在。对比E13.5对照组胚胎和E14.5对照组胚胎的后面区域的口鼻洞的宽度,以及对比E14.5维甲酸处理胚胎和E14.5对照组胚胎,我们可以观察到E14.5对照组胚胎的口鼻洞宽度比其他两组的口鼻洞大小宽(不管是E13.5对照组胚胎,还是E14.5维甲酸处理组胚胎)。在所有的E15.5对照组胚胎的腭突均完全接触和粘附,而与此不同的是维甲酸处理组胚胎的前面和后面区域的腭突仍然垂直向下生长并没有上抬。这样的情况在E17.5维甲酸处理胚胎仍然可以被观察到,对照组胚胎则形成了完整的继发腭。与对照组相比维甲酸处理组胚胎的腭呈现一个宽的间隙,最终形成宽泛的腭裂表型。B.E13.5和E14.5维甲酸处理胚胎的Wnt/β-catenin信号被抑制我们检测了从E13.5到E15.5维甲酸处理组胚胎和对照组胚胎发育中的腭突和舌组织的蛋白提取物中Wnt信号通路蛋白的表达情况。从E13.5到E14.5维甲酸处理胚胎中Gsk-3β的表达和对照组相比呈现出一种向下迁移的情况。我们检测到E13.5和E14.5维甲酸处理组Wnt/B-catenin信号通路分子表达均被下调,包括β-catenin、Lef-1、c-Jun和phospho-c-Jun。然而有趣地是在E15.5,维甲酸处理胚胎的Gsk-3β的蛋白水平和对照组相比并没有显著不同。与此变化一致的是,E15.5维甲酸处理组的胚胎Wnt信号通路的下游分子,如β-catenin和Lef-1呈现轻微的上调趋势,但c-Jun和phospho-c-Jun的表达在对照组胚胎和维甲酸处理组胚胎并无明显不同。C.前面区域的腭突间充质细胞的增殖由于维甲酸作用而显著增加和对照组胚胎相比,从E13.5到E15.5维甲酸处理组胚胎腭突的前面区域的间充质细胞中BrdU阳性表达的细胞,即增殖的细胞,都较多。D.E13.5和E14.5维甲酸处理胚胎的上皮细胞和间充质细胞凋亡发生改变在E13.5,成团的TUNEL阳性标记的细胞(即凋亡细胞)在对照组胚胎的前面区域腭突的口腔面上皮被检测到,然而在维甲酸处理组胚胎的相同区域却没有检测到凋亡细胞。我们还在维甲酸处理胚胎的腭突和颅底相交弯曲处的间充质细胞中检测到大量的TUNEL阳性标记细胞,而在对照组胚胎的相同区域却检测不到明显的凋亡细胞。在E13.5,大量的TUNEL阳性标记的细胞在对照组胚胎的口腔底上皮细胞处被检测到,然而维甲酸处理胚胎的口腔底上皮却鲜有凋亡细胞被检测到。在维甲酸处理胚胎前面区域的原始舌系带处的间充质细胞及后面区域的原始颏舌肌处的间充质细胞和对照组胚胎相同区域的间充质细胞相比TUNEL标记的凋亡细胞都显著较多。在E14.5,凋亡细胞在对照组胚胎腭突的前面区域的口腔面上皮较为明显的,但在维甲酸处理组胚胎的相同区域凋亡细胞却不明显。我们检测到在对照组胚胎的口腔底上皮细胞存在大量的凋亡细胞,但在维甲酸处理组胚胎的相同区域却没有检测到明显的凋亡细胞。维甲酸处理组胚胎的原始舌系带处的间充质细胞有大量的TUNEL阳性标记的凋亡细胞,对照组胚胎相应的区域却没有检测到凋亡细胞的存在。在E15.5,我们在维甲酸处理组胚胎和对照组胚胎前面区域的腭突中间缘上皮处均检测到大量的凋亡细胞。(三)二噁英诱导腭裂A.二嗯英处理组的胚胎展示腭裂我们选用64μg/kg二嗯英在E12诱导腭裂作为二嗯英诱导腭裂发生的检测分析作用浓度及时间,在此浓度和作用时间昆明孕鼠展示了89%腭裂率,并且没有观察到除腭裂外的其他颅颜畸形。相同条件下对照组的孕鼠胚胎并没有发现腭裂发生。从扫描电镜的结果我们可以观察到对立的腭突可以抬高但是不能融合。在E13.5,二噁英处理组胚胎的前面及后面区域的腭突和对照组胚胎对应区域的腭突形态学上相似。与对照组不同的是,所有的E14.5二嗯英处理的胚胎前面区域和后面区域的腭突均是垂直向下生长的。在E15.5,所有对照组胚胎腭突均上抬并且相互靠近后接触、粘附及开始融合；然而,二噁英处理组胚胎的腭突只有部分上抬,另一些却仍然垂直生长。比较E13.5对照组胚胎和E14.5对照组胚胎后面区域的口鼻洞的宽度,以及比较相同区域E14.5二噁英处理组胚胎和E14.5对照组胚胎,我们均发现E14.5对照组胚胎后面区域的口鼻洞的宽度比其他组的宽。当我们对比E13.5二嗯英处理组胚胎和E14.5二嗯英处理组胚胎后面区域的口鼻洞的宽度,我们发现E14.5二噁英处理组胚胎后面区域的口鼻洞的宽度较宽,并且E15.5二噁英处理胚胎的口鼻洞的宽度较E14.5二噁英处理组胚胎的相同区域宽。在E17.5,几乎所有的二噁英处理腭突都抬高,但腭突间有一裂隙,最终显示腭裂表型,而对照组胚胎展现了完整的继发腭。B.从E13.5到E15.5二噁英处理组胚胎腭突和舌组织的Wnt5a和Lef-1的蛋白表达被下调我们检测了从E13.5到E15.5二噁英处理组胚胎和对照组胚胎发育中的腭突和舌组织的蛋白提取物中Wnt信号通路蛋白的表达情况。从E13.5到E15.5,对照组胚胎和二噁英处理组胚胎的腭突和舌组织中的Gsk.3β、β.catenin和c-Jun蛋白表达没有明显不同。然而,和对照组胚胎相比,由于二噁英的作用转录因子Lef-1的表达却被下调。在E14.5和E15.5和对照组胚胎相比,二噁英处理组胚胎腭突和舌组织中的Lef-1下游分子phospho-c-Jun的表达却被上调。二噁英处理组胚胎腭突和舌组织中Wnt3a和Wntll(Wnt配体)的表达和对照组相比并没有显著不同,但从E13.5到E15.5二嗯英处理组胚胎腭突和舌组织中Wnt5a的水平却均被下调。C.二噁英处理组胚胎的细胞增殖和凋亡从E13.5到E15.5二嗯英处理组胚胎与对照组胚胎相比腭突的前面和后面区域、口腔底的上皮及间充质细胞的细胞增殖和细胞凋亡并没有显著不同。结论哺乳动物发育过程中腭突的接触、粘附及融合对于继发腭的形成起着重要的作用,腭突接触、粘附及融合的失败将直接导致腭裂的发生。我们的研究结果显示胚胎腭突中间缘上皮细胞的增殖和凋亡机制可以被地塞米松作用于孕鼠而干扰,从而影响腭的发育,致使腭不能融合,形成腭裂。经典的Wnt/β-catenin信号通路分子的下调与地塞米松诱导的腭裂相关,而被下调的信号分子改变的细胞命运直接与地塞米松诱导腭裂的形态学特征相符合。在E12用维甲酸处理孕鼠后维甲酸阻止腭突的上抬是腭裂发生的主要原因。我们的研究证实了之前的文献没有报道的一种分子信号机制,即维甲酸诱导的腭裂与下调经典的Vrit/β-catein信号通路相关,通过信号分子的变化直接改变了细胞的命运,从而塑造了维甲酸诱导腭裂发生的形态学特征。我们的结果展示了二噁英诱导昆明孕鼠后在腭突发育的关键时期E13.5到E15.5抑制了非经典Vnt/Ca2+信号通路,并且显著延迟了腭突的上抬,我们认为这是二噁英诱导腭裂高发生率的主要原因。本这些研究发现有助于帮助提高地塞米松、维甲酸和二噁英致畸的机制研究及腭裂发生的病因学研究。