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目的：利用GeXP多重基因表达系统建立两种多重逆转录-聚合酶链式反应(mRT-PCR)的方法，分别检测TCR Vα和TCR Vβ链的CDR3谱型及长度，用于分析T细胞克隆增殖情况。分析肺癌患者胸水中TIL的TCR Vα和TCR Vβ家族的克隆增殖情况，并克隆具有寡克隆或单克隆增生现象的TCR Vα和TCR Vβ基因构建重组嵌合型腺病毒pDC315-TCRVα-IRES-TCRVβ。研究此TCR Vα和TCRVβ基因修饰的PBMC对不同肿瘤细胞的杀伤作用，确定是否为肺癌相关的TCR基因，为以后发现肿瘤特异性TCR基因并利用特异性TCR基因修饰T细胞进行过继免疫治疗打下基础。方法：一、收集正常人外周血，分离出单核细胞，提取总RNA，利用GeXP多重基因表达系统建立多重逆转录-聚合酶链式反应的方法检测人PBMC中22个TCR Vβ家族的CDR3的谱型和长度，用于分析亚家族的比例以及克隆增殖情况。二、收集正常人外周血，分离出单核细胞，提取总RNA，利用GeXP多重基因表达系统建立多重逆转录-聚合酶链式反应的方法检测人PBMC中32个TCR Vα亚家族的CDR3的谱型长度，用于分析亚家族的克隆增殖情况。三、收集肺癌患者胸水，分离出单核细胞，提取总RNA，利用上述建立的两种方法分析肺癌患者胸水中TIL的TCR Vβ家族和TCR Vα家族的克隆增殖情况。四、提取肺癌患者胸水单核细胞的总RNA，克隆肺癌患者胸水TIL中呈现寡克隆增殖的的TCR Vβ基因和TCR Vα基因，并构建腺病毒穿梭质粒pDC315-TCRVα-IRES-TCRVβ。五、通过Lipofectamine2000脂质体转染的方法，将腺病毒骨架质粒与构建的腺病毒穿梭质粒pDC315-TCRVα-IRES-TCRVβ共转染HEK293细胞，包装表达目的基因的重组腺病毒。获得的初病毒提取病毒基因组DNA，PCR扩增目的基因。用病毒转染淋巴细胞，检测目的基因表达情况。将鉴定正确的重组嵌合型腺病毒进行大量扩增，过滤TCID50法测病毒滴度。用重组腺病毒感染PBMC，36小时后分别作用于肺癌细胞株NCI-H1299（HLA-A2+）、NCI-H1299（HLA-A2-）、肝癌细胞株HepG2（HLA-A2+），7402（HLA-A2-）。用MTT法在12h、24h、36h三个时间点检测杀伤效果。结果：成功地利用GeXP多重基因表达系统建立两种多重逆转录-聚合酶链式反应(mRT-PCR)的方法，检测出22个TCR Vβ家族以及32个TCR Vα家族CDR3长度以及谱型情况。GeXP检测5例肺癌患者胸水中TIL的TCR Vβ家族和TCR Vα家族的CDR3谱型，结果显示除P2病人所有家族均为多克隆外，其余四例患者均出现单克隆性或寡克隆性增生的现象，通过测序，P1寡克隆增生的TRBV21(TRBV21-TRBD2-TRBJ2S1)和TRAV26(TRAV26-TRAJ20)；P3寡克隆增生的TRBV21(TRBV21-TRBD1-TRBJ2S1)和TRAV17(TRAV17-TRAJ20)；P4寡克隆增生的TRBV21(TRBV21-TRBD1-TRBJ2S1)和TRAV7(TRAV7-TRAJ5)；P5单克隆增生的TRBV17(TRBV17-TRBD2S2-TRBJ2S1)和TRAV5(TRAV5-TRAJ27)。从P5患者中成功克隆获得TCR Vα5和TCR Vβ17基因，并正确构建了重组腺病毒穿梭质粒pDC315-TCR Vα5-IRES-TCR Vβ17。通过Lipofectamine2000脂质体转染的方法，利用腺病毒包装细胞包装重组腺病毒。提取重组腺病毒基因组，PCR扩增得到Fiber35和TCR Vβ17基因，说明目的基因已经整合到病毒基因组中。病毒感染PBMC后流式检测，目的基因得到有效表达。用重组腺病毒感染PBMC后，进行抗肿瘤细胞实验，发现经TCRVα5-TCRVβ17基因转染的PBMC的抗肿瘤能力为NCI-H1299(HLA-A2+)>HepG2(HLA-A2+)>NCI-H1299(HLA-A2-)>7402(HLA-A2+)。结论：GeXP检测五例肺癌患者TIL，均出现了TCR Vα和TCR Vβ家族的寡克隆或单克隆增生的现象（除P2），推测可能是由于在肿瘤局部的特异性抗原诱导产生的。从肺癌患者胸水中克隆获得TRAV5（TRAV5-TRAJ27）和TRBV17(TRBV17-TRBD2S2-TRBJ2S1)基因，并成功构建了重组腺病毒载体。杀伤实验显示重组TCR腺病毒感染的PBMC对两株肺腺癌细胞株均具有杀伤效果，但对HLA-A2+肺腺癌细胞的杀伤效率明显高于HLA-A2-肺腺癌细胞，并且对非肺癌细胞7402细胞没有杀伤效果，说明该寡克隆增生的TCR Vα和TCR Vβ家族是由肺癌引起的特异性增殖T细胞。