研究背景高尿酸血症是由于尿酸生成过多或排泄减少所导致的代谢性疾病,不仅是痛风的生化基础,亦与糖脂代谢紊乱、心血管疾病等密切相关,已成为一种常见、高危的慢性代谢性疾病,被认为是除高血压、糖尿病和高脂血症外影响人类健康的“第四高”。目前降尿酸西药存在不同程度的不良反应,且多数对多代谢紊乱的高尿酸血症的防治效果不佳。由此,开展中药防治高尿酸血症的研究具有重要的临床现实意义。机体内尿酸约2/3从肾脏排出,1/3经肠道排出,肾脏作为对尿酸排泄贡献率较大的器官,受到人们的广泛研究,而肾外尿酸排泄机制尚不明确。近年来研究指出,肠道作为肾外尿酸排泄的主要途径,在高尿酸血症的形成中有重要作用,而具体作用机制并未阐明。有研究显示肠道 ABC 转运蛋白 2（ATP-binding cassette superfamily gmember2,ABCG2）是高容量的尿酸转运体,可将尿酸作为底物转运排出体外,其表达及功能障碍与尿酸肠道排泄减少有关。提示肠道尿酸转运体ABCG2的表达及功能障碍与高尿酸血症的发生存在病理联系,其在肠道尿酸排泄过程中发挥重要作用。此外,临床及实验研究发现高尿酸血症患者的肠道菌群、肠道通透性等肠屏障指标发生病理改变,内毒素入血增加。目前尚无作用于肠道尿酸排泄途径的降尿酸药物的临床应用。结合中药多途径多靶点的作用特点,从尿酸的肠道排泄途径,开展中药防治高尿酸血症的作用机制研究具有重要的学术价值。中药菊苣为维吾尔族与蒙古族习用药材,功效清肝利胆,健胃消食,利尿消肿。本实验室长期从事中药菊苣及高尿酸血症的研究,发现中药菊苣可稳定降低血尿酸水平,并从嘌呤代谢途径及肾脏尿酸排泄途径对菊苣降尿酸作用机制进行了研究。本研究属于中药菊苣药理药效研究的一部分,切入肠道尿酸转运蛋白ABCG2,从尿酸的肠道排泄途径,结合肠道屏障,对菊苣提取物降尿酸的作用环节和干预机制进行探讨。工作假说肠道转运体ABCG2 mRNA表达降低与肠道屏障障碍共同下调肠道转运体ABCG2蛋白表达,导致的肠道尿酸排泄减少是果糖诱导大鼠高尿酸血症的发生机制之一。中药菊苣可上调肠道转运体ABCG2 mRNA表达,并改善肠道屏障障碍,增加肠道转运体ABCG2蛋白表达,促进肠道尿酸排泄,发挥降尿酸作用。研究目的第一,切入肠道尿酸转运蛋白ABCG2,着眼于尿酸肠道排泄途径,明确肠道尿酸转运蛋白ABCG2与果糖诱导的大鼠高尿酸血症的病理联系;并观察肠道尿酸转运蛋白ABCG2相关的以肠道屏障为主的肠内环境的改变,进一步对果糖诱导的大鼠高尿酸血症的病理基础进行阐释。第二,分析中药菊苣提取物对果糖诱导的高尿酸血症大鼠肠道尿酸转运蛋白ABCG2、肠道尿酸排泄并肠道屏障环境改变的影响,探讨其发挥降尿酸的作用环节和干预机制。研究方法本论文包括文献综述和实验研究两部分。文献综述部分通过查阅国内外文献,对高尿酸血症的流行病学研究进展、高尿酸血症药物治疗研究进展、转运蛋白与肠道尿酸排泄研究进展、肠道屏障与肠道尿酸排泄研究进展进行梳理。实验研究部分利用生化检测、高效液相、酶联免疫吸附、蛋白质免疫印迹、实时荧光PCR等手段,从整体动物、在体器官、组织形态、体外细胞、蛋白分子多层面,切入肠道尿酸转运蛋白ABCG2,从尿酸的肠道排泄途径,结合肠道屏障,探讨果糖诱导的大鼠高尿酸血症的病理基础,阐释中药菊苣提取物对高尿酸血症的干预作用。实验研究内容分为两个章节第一章 高尿酸血症与肠转运蛋白ABCG2表达变化的病理联系研究复制高果糖诱导的大鼠高尿酸血症模型,观察高尿酸血症形成过程中,小肠各肠段中尿酸转运体ABCG2的蛋白及基因表达水平的改变;检测实验动物粪便及规定时间内肠腔内尿酸含量;观察实验动物肠道机械屏障和肠道生物屏障相关指标的病理改变。第二章菊苣提取物对高尿酸血症状态下肠转运蛋白ABCG2表达的干预研究在病理研究基础上,开展中药菊苣提取物的药理药效研究。明确菊苣提取物降尿酸药效,观察菊苣提取物对果糖诱导的高尿酸血症大鼠肠道尿酸转运体ABCG2的蛋白和基因表达水平的影响,及对模型动物粪便及规定时间内肠腔内尿酸含量的影响;观察菊苣提取物对高尿酸状态下Caco-2中ABCG2表达的影响;观察菊苣提取物对高尿酸血症状态下肠道机械屏障和肠道微生物屏障相关指标的影响;观察菊苣提取物对甲氨喋呤和氧嗪酸钾塑造的肠道屏障功能损伤并高血尿酸动物模型的肠道屏障功能的影响。研究结果高尿酸血症与肠转运蛋白ABCG2表达变化的病理联系研究显示:①10%高果糖饮水可引起大鼠持续的高血尿酸水平。ABCG2蛋白表达于大鼠十二指肠、空肠、回肠的肠绒毛及肠腺中,在肠绒毛中,分布于肠上皮细胞的膜及胞质中,在肠腺中,分布于肠腺的腔面胞膜和核上方胞质。免疫组化半定量分析显示,与正常组相比,模型动物空肠ABCG2蛋白阳性表达面积和积分光密度显著减少。实时荧光PCR分析显示,与正常组相比,模型动物空肠与回肠的ABCG2mRNA表达显著降低。②规定时间内模型动物粪便中尿酸含量和在体肠道灌流液中的尿酸含量均显著低于正常组。③与正常组相比,模型动物血清二胺氧化酶、D-乳酸、内毒素水平显著升高;各肠段杯状细胞数量、体积减少,肠绒毛纹状缘边际不清晰,肠绒毛上皮细胞细胞核排列相对散乱,尤见于空肠和回肠。模型动物肠道菌群宏观结构变化;肠内大肠杆菌数量显著增加,粪肠球菌数量有上升趋势,乳酸菌和双歧杆菌数量无明显改变。菊苣提取物对高尿酸血症状态下肠转运蛋白ABCG2表达的干预研究显示:①菊苣提取物可稳定降低模型动物血尿酸水平。免疫组化染色、Western blot与实时荧光PCR显示菊苣提取物可显著增加模型动物空肠和回肠的ABCG2蛋白及基因表达水平。菊苣提取物可显著降低模型动物粪便及肠道灌流液中的尿酸含量。②菊苣提取物可显著降低高浓度尿酸培养下的Caco-2细胞中ABCG2二聚体表达。③菊苣提取物可降低模型动物血清二胺氧化酶、D-乳酸、内毒素含量,增加肠粘膜杯状细胞数量;改变模型动物肠道菌群宏观结构和主要宿主菌含量,使大肠杆菌、粪肠球菌数量减少,双歧杆菌数量增加。④菊苣提取物可显著降低甲氨喋呤和氧嗪酸钾塑造的肠道屏障功能损伤并高血尿酸动物模型的血清内毒素水平,对其血清二胺氧化酶、D-乳酸,及小肠匀浆髓过氧化物酶水平有降低趋势;并可明显减少盲肠内容物EC肉汤平板培养菌落数,对小肠系膜淋巴结血平板培养菌落数未有明显改变。研究结论研究结果证实并修正了工作假说,得出以下结论:①肠道尿酸转运蛋白ABCG2表达降低与果糖诱导的大鼠高尿酸血症存在病理联系。肠道转运蛋白ABCG2 mRNA表达降低与肠道屏障障碍共同下调肠道转运蛋白ABCG2蛋白表达,从而导致的肠道尿酸排泄量的减少可能是果糖诱导的大鼠高尿酸血症的病理机制之一。②菊苣提取物可通过上调肠道转运体ABCG2mRNA表达,改善肠道屏障障碍,增加肠道转运蛋白ABCG2蛋白表达,促进果糖诱导的高尿酸血症大鼠的肠道尿酸排泄,发挥降尿酸作用。创新点①首次切入肠道尿酸转运蛋白ABCG2,从尿酸的肠道排泄途径,开展了菊苣提取物对果糖诱导的大鼠高尿酸血症的干预研究。明确了肠转运蛋白ABCG2 mRNA上调ABCG2蛋白表达,促进肠道尿酸排泄量可能是菊苣提取物发挥降尿酸作用的机制之一。②首次开展了菊苣提取物对高尿酸血症状态下肠道尿酸转运蛋白ABCG2相关的肠道屏障病理改变的影响研究,为菊苣提取物降尿酸作用的进一步研究奠定基础。