研究背景近年来,氧化应激作为骨质疏松的一个危险因素己受到高度重视,其中以FoxO/Wnt通路在氧化应激(Oxidative stress, OS)介导的骨质疏松中的研究最为广泛深入。越来越多的研究表明,人体在衰老,或罹患某些疾病,或服用某些药物时,体内活性氧自由基(Reactive oxygen species, ROS)大量蓄积,诱发氧化应激,通过激活FoxO通路和抑制Wnt通路,导致机体出现骨质疏松症状。因此,应用具有抗氧化活性的物质有可能是防治骨质疏松的新靶点。本课题组前期研究表明,丹参中的水溶性酚酸类成分丹参素是天然抗氧化物质,具有防治糖皮质激素诱发骨丢失的作用,可能与其逆转骨髓基质干细胞Wnt通路的抑制有关。然而,是否丹参素抗骨质疏松的作用与其抗氧化作用有关尚未见报道。基于此,本课题组提出假说,认为丹参素可能降低ROS过度蓄积聚,抑制氧化应激,进而引起FoxO信号通路下调,并通过刺激Wnt通路的激活而发挥抗骨质疏松作用。因此,本研究以丹参素为研究对象,分别采用体外细胞和整体动物复制氧化应激模型,探讨丹参素对氧化应激介导的骨质疏松的作用,并阐明其对FoxO/Wnt通路影响的作用机制,为中药丹参骨代谢药理作用深入研究及天然抗氧化剂在骨代谢性疾病的应用提供新思路和实验依据。研究目标1.通过体内和体外实验探讨氧化应激诱导成骨细胞损伤和骨质疏松的病理机制；2.研究和证明丹参素通过对抗氧化应激的作用,从而促进成骨细胞分化与骨形成功能,,探讨抗氧化应激效应在骨组织保护方面的作用；3.证实丹参素通过下调FoxO通路与上调Wnt信号产生抗骨质疏松作用,为天然抗氧化剂治疗骨质疏松症奠定理论基础和提供实验依据。研究内容和检测指标1.体外实验研究：以具有多分化潜能的细胞株(C2C12细胞)为研究对象,采用H202处理和丹参素干预,主要检测以下指标：MTT检测细胞活力检测,荧光显微成像和透射电镜检测细胞凋亡形态,DCFH-DA荧光探针结合流式细胞分析技术检测氧化应激状态,ELISA检测成骨分化标志物水平,pRT-PCR结合Western Blot检测FoxO3a与Wnt信号通路中相关基因与蛋白的表达水平,瞬时转染法与双荧光素酶报告基因技术检测FoxO3a和Wnt信号通路的变化情况,主要包括以下内容：1.1观察氧化应激对细胞存活、增殖及分化的影响及丹参素的干预作用；1.2探讨氧化应激对FoxO/Wnt信号通路和下游基因及其相关蛋白表达的影响,并探讨丹参素的对FoxO/Wnt通路的调控作用；1.3分析丹参素促进成骨分化、对抗氧化应激及其对FoxO/Wnt信号通路调控之间的关系,从而在细胞水平、分子水平和基因水平研究氧化应激介导的FoxO/Wnt信号转导对成骨细胞活性和功能的影响及丹参素的调控作用。2.在体实验研究：分组与给药：32只4月龄雌性SD大鼠随机分为4组：正常对照组(Con)、模型组(GC)、丹参素组(Tan)和对照药白藜芦醇组(Res),每组8只。模型组大鼠灌胃给予醋酸泼尼松,剂量为5mg/kg·d体重,用0.5%CMC-Na配制；Con组动物每日灌胃给予0.5%CMC-Na溶液。Tan和Res组除按以上方法给予醋酸泼尼松外,分别给予丹参素(20mg/kg·d体重)和白藜芦醇(5mg/kg·d体重),用0.5%CMC-Na配制。以各组动物每日给药1次,上午给予醋酸泼尼松,下午给予受试药物,连续14周。取材与检测指标：实验结束时,用3%戊巴比妥钠(1.5ml/kg)行腹腔注射麻醉,右心室彻底抽血处死。分离血清后,采用ELISA法和比色法检测骨转换生化标志物和抗氧化指标；大鼠右侧胫骨近端、中段和第4腰椎(L4)用作骨组织形态计量学方法检测骨组织结构的静态与动态变化；右侧股骨和L5分别用DXA技术检测骨密度(BMD)、三点弯曲法检测骨生物力学性能和Micro-CT技术检测骨组织微三维结构特性；左侧股骨用作TUNEL法检测细胞凋亡情况；左侧胫骨骨髓细胞用DCFH-DA荧光探针检测骨髓细胞氧化应激水平,左侧胫骨和L6使用Western blot和PCR检测成骨分化与成脂分化的相关指标和FoxO/Wnt通路中关键信号分子。研究内容：2.1研究丹参素对糖皮质激素诱导骨质疏松模型的成骨分化能力、骨转换水平、骨结构、骨密度和骨质量相关参数的影响；2.2检测骨组织中氧化应激水平与细胞凋亡情况,结合血清中抗氧化的生化指标,探讨丹参素在氧化应激状态下对大鼠骨组织FoxO/Wnt信号通路的影响;2.3探讨丹参素防治骨质疏松作用、抗氧化应激能力及其与FoxO/Wnt信号转导调控之间的关系,从而在整体动物水平揭示丹参素通过调控FoxO/Wnt信号通路抑制氧化应激介导骨质疏松的作用及机制。3.统计分析：实验结果用均数士标准差(x士SD)表示,采用统计软件SPSS20.0进行分析,组间比较用one-way ANOVA、以p<0.05定为差异有统计学意义。方差齐性时,采用Fisher least significant difference (LSD)方法进行组间多重比较；方差不齐时,采用DunnettT3进行组间多重比较。实验结果1.体外实验1.1MTT检测的结果表明,不同浓度的丹参素(0.0001-1000μM)均可不同程度地促进C2C12细胞增殖,以1μM为最佳实验浓度(P<0.05)；在不同浓度的H2O2(0.025-1.2mM)处理下,C2C12细胞出现氧化应激的最适实验浓度为浓度为0.2mM(P<0.05)。1.2MTT检测和DCFH-DA染色结合流式细胞技术检测的结果表明,丹参素可抑制H2O2造成C2C12细胞死亡和ROS的升高(P<0.05)；采用ELISA检测、Hoechst33258染色和透射电镜检测,结合Western Blot分析,并采用瞬时转染法导入FoxO-luc荧光素报告序列,我们发现丹参素的作用机制主要是通过对抗H2O2激活与氧化应激相关的FoxO3a转录因子有关,并且丹参素能够解除细胞周期阻滞(P<005),同时也能够减少Caspase3依赖性的细胞凋亡(P<0.05)。1.3ALP染色、茜素红染色与ALP和OCN定量检测结果表明,H2O2可抑制BMP-2(100ng/ml)对C2C12细胞的促成骨分化作用(P<0.05),并能够降低ALP活性(P<0.05),减少OCN表达水平(P<0.05)和矿化活性；结合Western Blot分析和Tcf-luc荧光素报告序列转染检测法,初步证实H2O2的作用机制与抑制负责成骨分化的Wnt/β-catenin/Tcf信号通路有关,而丹参素均可不同程度地对抗H2O2对成骨分化的抑制作用(P<0.05)。1.4为了进一步证实前述结论,我们使用H2O2(0.2mM)与丹参素共同孵育,最后分别采用qRT-PCR检测Wnt与FoxO3a信号通路下游靶基因的变化。结果发现,H2O2抑制Wnt信号通路的靶基因Axin2、ALP和OPG的mRNA表达水平(P<0.05),同时激活FoxO3a转录因子活性及其靶基因Gadd45a和CAT的mRNA表达水平(P<0.05),丹参素可以对抗H2O2引起的变化(P<0.05)。综上所述,体外实验结果表明,丹参素通过调控Wnt/FoxO通路对抗氧化应激对成骨分化的影响。2.体内实验2.1体重动态变化分析：各组大鼠每周平均体重变化的结果显示,在整个14周的实验期间,实验组动物平均体重低于正常对照组。自第3周后,GC组动物体重与正常对照组具有显著性差异(P<0.05)；与GC组相比,丹参素给药组与对照药处理组的动物体重呈增高趋势,第11周以后具有显著性差异(P<0.05)。2.2糖皮质激素对大鼠的骨生物学作用：(1) ELISA法检测大鼠血清中骨转换生化指标的结果表明,GC能够引起大鼠的OCN、OPG和OPG/sRANKL比值下降(P<0.05), BAP呈下降趋势,但无统计学意义(P>0.05),而sRANKL和TRAP5b显著升高(P<0.05),说明GC引起大鼠骨形成能力降低,骨吸收能力升高。(2)DXA检测大鼠股骨和腰椎BMD的结果表明,GC组大鼠的BMD呈下降趋势,但结果较正常对照组没有显著性差异(P<0.05)。(3)骨组织形态计量学的检测结果表明,GC处理引起大鼠骨小梁面积减小(P<0.05),数目减少(P<0.05),骨小梁稀疏细薄(P<0.05),间距增大(P<0.05),导致松质骨结构损坏,同时骨形成活动减少,骨吸收活动频繁,导致松质骨骨量下降；GC对皮质骨结构和骨外膜活动的影响没有显著性变化(P>0.05),而骨内膜破骨细胞活动增加(P<0.05),表面形成增多,导致内皮质骨骨转换率增加,骨髓腔增大,皮质骨量减少。(4)采用Micro-CT检测股骨组织微结构特性的结果表明,GC可引起大鼠松质骨中的BV/TV和Tb.Th降低(P<0.05),而Tb.SP、SMI和DA升高(P<0.05),提示GC处理后,大鼠松质骨骨小梁连接降低,骨小梁变薄。(5)采用三点弯曲试验检测生物力学性能的结果表明,GIO大鼠股骨的结构力学参数弹性载荷和弯曲能量均较正常对照组有不同程度的下降(P<0.05),而另一结构力学参数断裂载荷和材料力学参数刚性系数呈下降趋势,但没有统计学意义(P>0.05),表明GIO大鼠骨抵抗变形能力下降,骨生物性能降低,骨折危险性增加。综上所述,GC引起大鼠骨形成能力下降,骨吸收能力增加,骨转换率增加,骨量下降,松质骨结构受到破坏,骨生物力学性能降低,骨折危险性增加,导致出现继发性骨质疏松症状。2.3丹参素对GIO大鼠的防治作用：本实验结果表明,与GC组相比,丹参素与白藜芦醇能够调节骨转换生化指标的变化,产生抑制骨吸收和促进骨形成作用(P<0.05)；丹参素与白藜芦醇对GIO大鼠股骨和腰椎BMD的没有显著性的影响(P>0.05)；丹参素与白藜芦醇对骨组织形态计量学参数的改变有一定影响,可使GC处理导致的松质骨结构损坏得到修复(P<0.05),并能促进骨形成增加和骨吸收下降(P<0.05),从而防止松质骨骨量下降,同时,也能降低GC致皮质骨内膜活动(P<0.05),从而对抗GC致高转换率状态,抑制皮质骨骨量下降；丹参素与白藜芦醇对Micro-CT检测的相关指标也具有一定影响,能够抑制松质骨中的BV/TV和Tb.Th降低(P<0.05),并对抗Tb.SP、SMI和DA升高(P<0.05),从而对GC致大鼠松质骨骨小梁连接降低和骨小梁变薄具有不同程度的对抗作用；丹参素与白藜芦醇也能调节GIO大鼠的生物力学性能参数,能够增加结构力学参数弹性载荷和弯曲能量(P<0.05),具有对抗GC对骨生物力学的影响,增强骨骼的抵抗力,降低骨折风险。因此,丹参素与白藜芦醇对大鼠GIO症状均能够产生一定防治作用。2.4丹参素对GIO大鼠骨组织中氧化应激与细胞凋亡的影响：GIO大鼠骨组织中磷酸化p66shc表达增加(P<0.05), ROS蓄积(P<0.05), GSR活性下降(P<0.05),说明骨组织明显处于氧化应激状态,而丹参素与白藜芦醇均能够不同程度地对抗前述变化(P<0.05)；GC能够降低大鼠血清中SOD和CAT活性(P<0.05),升高MDA水平(P<0.05),丹参素与白藜芦醇均能够对抗GC引起的这些变化(P<0.05)。GC处理组大鼠骨组织中TUNEL染色对照染色细胞较正常对照组显著增多(P<0.05),而白藜芦醇及丹参素能够降低GIO大鼠骨组织中凋亡细胞的数量(P<0.05)。总之,GC能够激活大鼠骨组织中p66Shc/ROS信号,增加氧化应激水平,降低机体抗氧化能力,促使骨组织中细胞凋亡增加,而丹参素与白藜芦醇对骨组织均能够产生抑制氧化应激和抗凋亡的作用。2.4丹参素对GIO大鼠成骨分化与成脂分化的影响：GC能够增加脂肪分化的主要调控因子PPARy2的mRNA水平和蛋白质表达(P<0.05),抑制成骨分化调控因子Runx和Osteorix及功能蛋白OCN和Collal的mRNA表达情水平(P<0.05),而alpl的mRNA表达变化不明显(P>0.05)。结果提示,GC能够促进成脂分化,降低成骨分化,这也是GC诱导GIO的一个重要原因；丹参素与白藜芦醇均能够通过调节成骨分化与成脂分化而发挥其抗骨质疏松的作用。2.5丹参素对GIO大鼠骨组织中FoxO3a/Wnt信号通路的影响：GC能够引起骨组织中依赖于FoxO3a转录因子的敏感蛋白Gadd45a和FoxO3a表达增加(P<0.05), Wnt信号通路的指示分子Axin2和关键蛋白P-catenin表达减少(P<0.05),结果提示,GC可能直接促进FoxO3a的转录活性,抑制Wnt/p-catenin信号通路,并可能通过p66Sh/ROS/FoxO3a通路间接下调Wnt/p-catenin信号,揭示GC可能通过诱导骨组织产生氧化应激,抑制骨形成通路,从而引起并促进骨质疏松的病理进程,而丹参素和白藜芦醇均能够通过调控FoxO3a/Wnt信号通路发挥抗骨质疏松的作用。结论：丹参素具有防治氧化应激介导骨质疏松的作用,其可能机制是：通过下调p66shc/ROS/FoxO3a/caspase3信号通路发挥抗氧化应激作用；同时,丹参素直接上调经典Wnt/β-catenin/Tcf信号通路,或者通过抑制FoxO3a信号通路间接促进Wnt通路的激活,从而调控成骨分化功能,发挥抗骨质疏松作用。