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目的肿瘤的形成与发展是一个多基因、多步骤、多阶段的病理过程,有众多的信号传导通路参与这一过程。其中Wnt通路的作用,日益受到人们的重视。Dishevelled(Dvl)是Wnt通路中位于上游的正向调节因子,介导Wnt信号在细胞内的三条通路,即Wnt/β-catenin通路,非经典Wnt/PCP通路和Wnt/Ca2+通路。人类Dishevelled(Dvl)家族WDvl-1、Dvl-2和Dvl-3三个成员,在非小细胞肺癌中均存在过表达,但他们与患者预后的关系尚不清楚,不同亚型对肺癌细胞侵袭能力的影响和可能的机制也需要进一步研究和证实。方法1、材料80例原发性非小细胞肺癌患者的组织标本收集自中国医科大学附属第一医院病理科1998-2005年存档蜡块。全部标本均有术后随访记录。标本经4%中性甲醛固定,石蜡包埋,HE常规染色后明确诊断。2、免疫组织化学染色及结果判定标本用中性福尔马林溶液固定,石蜡包埋,制成4μm切片,经脱蜡,脱苯,水化后,采用链菌素抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组化法(S-P法)检测Dvl-1,Dvl-3,β-catenin和p120ctn蛋白表达。单克隆抗体小鼠抗人Dvl-1, Dvl-3单克隆抗体,鼠抗人β-catenin单克隆抗体,鼠抗人p120ctn单克隆抗体4℃孵育过夜。以正常支气管粘膜上皮细胞着色强度和定位为内对照,PBS缓冲液代替一抗为阴性对照。选肿瘤细胞阳性染色集中区域,每张切片计数400个癌细胞,由两名病理医师双盲观测。Dvl判定标准：我们将阳性细胞数<10%定为正常表达(negtive-),而将≥11%定为异常表达(positive+)。β-catenin判定标准：正常上皮组织中阳性表达并定位于细胞膜,我们将膜阳性瘤细胞数≤90%定为膜表达降低,膜表达降低和胞浆出现阳性统归为异常表达。p120ctn判定标准：p120ctn正常表达定位于细胞膜,我们将膜表达细胞数<90%或胞浆出现棕褐色颗粒统归为异常表达。3、RT-PCR采用TrizolTM试剂提取肺癌组织或培养细胞的总RNA,利用RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0试剂盒进行反转录。分别扩增Dvl-1、Dvl-3、p120ctn和P-catenin,以β-actin为内参。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后,成像分析。4、Western Blot将含80μg总蛋白的裂解产物进行SDS-PAGE电泳后,转印至PVDF膜,单克隆抗体Dvl-1, Dvl-3,β-catenin和p120ctn 4℃孵育过夜,辣根过氧化物酶标记二抗37℃孵育1h后DAB或ECL显色。5、细胞培养在37℃,含5% CO2的培养箱内培养人类肺癌细胞系LTEP-α-2和A549细胞系,培养基为含10%灭活胎牛血清的RPMI 1640,贴壁生长,每2-3天胰酶消化传代一次。6、质粒构建与转染将含有目的基因的载体导入感受态宿主细菌DH5a中扩增、纯化,测序验证后,使用Lipofectamine 2000转染试剂将质粒分别转染至肺癌细胞系LTEP-α-2和A549中培养,通过Western Blot和RT-PCR鉴定转染效果。7、Dual-luciferase Asssay按Lipofectamine2000转染试剂操作说明进行转染,将细胞种植于24孔板,并分别以pGL3-OT或pGL3-OF (0.5μg)报告基因质粒瞬时转染,共转染内对照质粒pRL-TK (50ng),37℃培养30hr。用双萤光报告检测试剂检测报告基因表达情况,Tcf介导的基因转录活性以pGL3-OT/pGL3-OF比值表示,萤光素酶活性数值分别以pRL-TK报告质粒的海肾素活性校正。为分析Dvl对β-catenin的影响,共转染pCS2-Myc-Dvl1或pMyc-cyto-Dvl3 (0.5μg),并以空质粒pCS2+或pMyc-cyto (0.5μg)控制质粒量。8、体外基质胶侵袭实验检测细胞侵袭能力按照BD公司说明操作,取100μl细胞悬液(5×106个／ml)滴入上室内,下室加入含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养液,上下室之间用孔径为8μm的聚碳酸酯微孔滤膜分开,将小室置370C,5%C02条件下放置后,弃去上室内液体,擦尽膜上Matrigel胶,100%甲醇固定30分钟,常规苏木素染色,光镜下计数细胞数。9、统计分析各组资料利用SPSS for Window 13.0进行统计分析。p<0.05有统计学意义。结果1、正常支气管上皮细胞的Dvl蛋白呈阴性表达,而在肺癌组织中,Dvl-1、3均存在过表达,阳性信号主要定位于胞浆,为弥漫分布。正常支气管上皮细胞p120ctn、P-catenin表达为细胞膜阳性,而在肺癌组织中主要表现为膜表达减弱或出现胞质异位表达。Dvl-1和Dvl-3在腺癌的阳性率均高于鳞癌,Dvl-1、Dvl-3过表达和β-catenin及p120ctn的异常表达均与NSCLC的低分化有关。有淋巴结转移的肺癌,其Dvl-3的阳性率和P-catenin及p120ctn的异常表达率显著高于未转移者。在Ⅲ-Ⅳ期患者中,Dvl-1及Dvl-3的阳性率和p120ctn的异常表达率明显高于Ⅰ-Ⅱ期。2、肺癌组织中Dvl-1的过表达与P-catenin异常表达相关,而Dvl-3的过表达与p120ctn异常表达相关,与P-catenin表达却无相关性。3、80例有完整随访资料的非小细胞肺癌,经Log-rank检验,其Dvl-3及p120ctn正常表达者与异常表达者平均生存时间差异存在统计学意义。而Dvl-1过表达和β-catenin的异常表达与生存时间未发现有意义的差异。将各病理因素输入Cox比例风险回归模型,经分析发现Dvl-3过表达、p120ctn异常表达、TNM分期及淋巴结转移为影响NSCLC预后的独立风险因素。4、选择Dvl-2稳定表达,而Dvl-1和Dvl-3低表达的A549和LTEP-a-2肺腺癌细胞系,分别转染Dvl-1和Dvl-3, RT-PCR显示转染前后β-catenin mRNA水平变化不明显,但Western blotting结果与未转染和空质粒组对比显示,转染Dvl-1肺癌细胞系的P-catenin蛋白表达上调,而转染Dvl-3肺癌细胞系的P-catenin蛋白表达下调。采用pGL3-OT/OF萤光素酶报告系统检测发现,过表达Dvl-1增强肺腺癌细胞p-catenin依赖的Tcf转录活性,而过表达Dvl-3抑制肺腺癌细胞β-catenin依赖的Tcf转录活性。5、在A549和LTEP-a-2肺癌细胞中过表达Dvl-1、Dvl-3均使p120ctn蛋白表达增高。RT-PCR结果显示,转染Dvl-1后,p120ctn mRNA变化不明显,而转染Dvl-3可明显增高p120ctn mRNA水平。6、分别转染Dvl-1和Dvl-3后,A549细胞及LTEP-a-2细胞侵袭至滤膜表面的肿瘤细胞数均明显高于空质粒组。转染Dvl-1并加入P-catenin抗体(100ng／ml)18h后,转染Dvl-3并加入p120ctn抗体(100ng/ml)18h后,细胞对基质胶的侵袭穿透能力均受到明显抑制。而转染Dvl-1并加入p120ctn抗体(100ng／ml)以及转染Dvl-3并加入β-catenin抗体(100ng／ml),却未发现对细胞的侵袭能力有明显的影响,因此Dvl-1通过β-catenin,而Dvl-3则可能通过p120ctn增强肺腺癌细胞侵袭能力。结论1、肺癌中不仅存在着Dvl-1和Dvl-3的过表达,而且其异常表达与NSCLC的分型、分化、淋巴结转移和TNM分期相关。2、Dvl-1过表达与β-catenin异常表达相关,Dvl-3过表达与β120ctn异常表达及肺癌的不良预后正相关,并可作为影响肺癌预后的独立危险因素。3、Dvl-1通过经典的Wnt信号通路促进肺癌细胞侵袭能力,而Dvl-3发挥促进侵袭的作用可能是通过β120ctn而实现的。