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孵化酶(Hatching Enzyme,HE)是动物胚胎孵化过程中起消化卵壳或卵膜作用的一类蛋白酶。目前,本课题组已报道家蚕孵化酶基因(BmHE I和BmHE II),两基因转录本均在家蚕胚胎发育后期高量表达,在孵化前期表达量达到最高峰。此外,BmHE I在幼虫期的中肠组织中特异性表达,BmHE II在五龄幼虫期至蛾期的精巢组织中特异性表达。为探索两家蚕孵化酶基因的组织特异性表达调控,本研究对两种家蚕孵化酶基因启动子进行功能分析,构建均一化全长cDNA文库,利用酵母单杂交的方法对其结合启动子的转录因子进行初步筛选。本研究主要获得以下结果:1.体外分析家蚕孵化酶基因I启动子活性:克隆BmHE I基因5’端依次截短的启动子片段分别插入到pGL3.0-Basic载体中构建报告载体,与pRL-CMV内参载体共同转染家蚕BmN细胞。结果表明:在BmN细胞内,BmHE I基因上游1.3kb的启动子能驱萤火虫荧光素酶的表达,但总体活性并不高,基因转录起始位点上游-40至转录起始位点为核心启动子区,删除-97~-40bp区域后其启动子活性明显增加,说明在该区域可能存在转录抑制因子结合位点。2.体内分析家蚕孵化酶基因启动子活性:构建pFBDLuc-P10RLuc双荧光素酶表达转移载体,分别由不同长度的BmHE I和BmHE II启动子片段驱动萤火虫荧光素酶(Luc)作为报告基因,由杆状病毒p10启动子驱动的海肾荧光素酶(Rluc)作为内参基因。通过Bac-to-Bac表达系统制备重组杆状病毒,分别注射五龄起蚕,测定中肠和精巢组织中各不同长度启动子片段的荧光素酶活性。结果表明:在BmHE I启动子中,-886~-509bp之间存在重要的组织特异性转录因子结合位点。在BmHE II启动子中,-1226~-819bp之间存在正调控转录因子结合位点。3.家蚕中肠和精巢组织全长均一化表达cDNA文库的构建:利用DSN酶与SMART技术构建家蚕五龄第3天中肠和精巢组织全长均一化cDNA文库,进一步将均一化文库插入酵母表达载体pGADT7-Sfi上,转化进大肠杆菌进行质粒扩增,并提取质粒。结果表明:中肠组织的初级文库的库容分别为1.9×10~6 cfu,表达文库的平均插入长度大于1kb,重组率为100%,冗余率为3%;精巢组织的初级文库库容为1.8×10~6 cfu,平均插入长度大于1kb,重组率为100%,冗余率为0%。两均一化表达文库质量合格,提取两文库质粒,分别得到质量良好的文库质粒总量各4mg。4.构建酵母诱饵菌株:将BmHE I启动子-543~-90bp(Ip-A)和-990~-486bp(Ip-B)的片段以及合成并三次串联重复含有HNF-1、GATA-1两个预测元件的(Ip-C)DNA片段作为诱饵片段;将BmHE II启动子扩增-455~-83bp区域(IIp-A)、-866~-398bp(IIp-B)的启动子片段以及合成含有WT1、PEA3、Ftz三个预测元件并三次串联重复的(IIp-C)DNA片段作为诱饵片段。成功构建了含BmHE I启动子片段或元件命名分别为Y1HGold[Ip-A-AbAi]、Y1HGold[Ip-B-AbAi]、Y1HGold[Ip-C-AbAi]的3个诱饵酵母菌株以及含BmHE II启动子片段或元件命名分别为Y1HGold[IIp-A-AbAi]、Y1HGold[IIp-B-AbAi]、Y1HGold[IIp-C-AbAi]的3个诱饵酵母菌株。5.利用酵母单杂交方法初步筛选孵化酶基因的转录因子:选取Y1HGold[Ip-B-AbAi]菌株进行中肠cDNA文库筛选,初步筛选出5个可能的转录因子,分别为aspartyl/asparaginyl beta-hydroxylase、leucine-rich repeat-containing protein 70、TBC1domain family member 16、KRR1 small subunit processome component homolog和regucalcin。选取Y1HGold[IIp-B-AbAi]菌株进行精巢cDNA文库筛选,初步筛选出7个可能的转录因子,分别为period(Per)、mimitin,mitochondrial、39S ribosomal protein L51、ribosomal protein L8、UPF0545 protein C22orf39 homolog、zinc finger CCCH domain-containing protein、nucleoporin NUP53。综上所述,本实验通过对家蚕孵化酶基因启动子的研究,找到了一些重要的与组织特异性调控相关的区域,构建家蚕中肠和精巢组织cDNA均一化表达文库,利用酵母单杂交系统初步筛选出与家蚕孵化酶基因启动子相结合的可能的转录因子。研究结果为进一步研究家蚕孵化酶基因的转录表达调控奠定基础。