【摘 要】
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猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)是近年来引起猪圆环病毒病(porcine circovirus associated diseases,PCVAD)的病原,导致猪群免疫抑制,世界各地均有PCV2的暴发与流行。目前猪群中以PCV2b、PCV2d为主要流行基因亚型,尤其是PCV2d呈上升趋势,给养猪业造成了较大经济损失。现有检测抗体主要基于PCV2b和PC
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猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)是近年来引起猪圆环病毒病(porcine circovirus associated diseases,PCVAD)的病原,导致猪群免疫抑制,世界各地均有PCV2的暴发与流行。目前猪群中以PCV2b、PCV2d为主要流行基因亚型,尤其是PCV2d呈上升趋势,给养猪业造成了较大经济损失。现有检测抗体主要基于PCV2b和PCV2a两个基因亚型,需要研制PCV2d特异性检测、诊断试剂。研制并获得PCV2d单克隆抗体(monoclonal antibody,MAb),对PCVAD的诊断和防治具有重要意义。本研究根据实验室保存的猪圆环病毒2d型(PCV2d/Changzhou/JS/20150728 CZ)的衣壳蛋白基因设计一对引物,利用PCR技术扩增出去核定位信号的or.f2基因,并插入原核表达载体质粒pET28a中,构建重组表达载体pET28a-orf2。将重组表达载体导入宿主菌BL21(DE3)中进行诱导表达,经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western-blot检测,初步证明His-rCap蛋白获得了表达,且具有良好的抗原性,通过对His-rCap蛋白表达条件的优化,增加可溶性蛋白的表达量。优化表达的His-rCap重组蛋白,通过Ni-NTA亲和层析介质纯化后免疫6周龄的雌性Balb/c小鼠,三次免疫后,取免疫小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,采用间接ELISA及IFA两种方法同时检测,经过3次亚克隆获得4株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1D9、2C3、3F9、4D11。通过Western-blot对4株单抗特异性进行鉴定,结果显示4株单抗均具有良好的特异性;间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)检测结果表明,1D9、3F9、4D11 3 株单抗与PCV2d、PCV2b毒株均有反应,1D9、3F9与PCV2d反应性更强,而4D11与PCV2b反应性更强,但2C3无荧光反应性。本研究制备的MAb为抗原表位的鉴定提供了工具,并可用于PCV2d、PCV2b基因亚型病毒的鉴定,为当前PCV2流行病学调查、研究提供可靠制剂。通过逐步截短去除核定位信号肽PCV2d orf2的基因,设计13对特异性引物,成功构建系列截短orf2基因的重组表达质粒。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),在37℃、IPTG诱导下进行表达。通过对重组大肠杆菌的菌体超声裂解产物进行SDS-PAGE电泳及Western-blot鉴定,表明重组大肠杆菌均能正确表达截短的融合Cap蛋白。将4株单抗与重组的截短Cap蛋白进行Western-blot鉴定,确定单抗1D9、3F9识别Cap蛋白的75NIND78表位,2C3识别900TVPFEY95,4D11识别225NLKDPPLNP233。中和试验结果表明,4株单抗均无中和活性。4株单抗的获得为目前流行的PCV2d、PCV2b的鉴定,以及基于单抗的血清流行病学调查方法的建立提供了可靠、易于标准化的高质量制剂。
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