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目的:观察重组人肠三叶因子(recombinant human intestinal trefoil factor, rhITF)对烧伤后肠道免疫功能的影响并探讨其可能的机制。 方法:本课题分为体外实验和体内实验两个部分。体外实验采用大鼠小肠上皮细胞株(intestinal epithelial cells,IEC-6)传代培养模型,在正常IEC-6和烧伤血清损伤的IEC-6两个层面观察ITF对其免疫功能的影响。在第一层面,将细胞分为正常对照(control,C)组、rhITF(I)组、黏蛋白(mucin,M)组和rhITF加黏蛋白(I+M)组,培养条件分别为常规培养(DMEM+10%小牛血清)、常规培养+25μg/ml rhITF、常规培养+250μg/ml黏蛋白以及常规培养+25μg/ml rhITF+250μg/ml黏蛋白。在第二层面,将细胞分为烧伤对照(burn,B)组、烧伤加rhITF(B+I)组、烧伤加黏蛋白(B+M)组和烧伤加rhITF和黏蛋白(B+I+M)组,培养条件与上述4组类似,不同之处是用10%烧伤大鼠血清替换10%小牛血清,其他条件不变。分别采用瑞氏吉姆萨染色法、细胞计数法和放射免疫法观察IEC与大肠杆菌黏附数量、细胞存活率以及分泌炎性介质能力的变化。 体内实验将102只BALB/c小鼠随机分为正常对照(C)组,烧伤对照(B)组、rhITF低剂量(1 mg/kg)组、rhITF中剂量(2.5 mg/kg)组和rhITF高剂量 (5 mg/kg)组。C组只给予麻醉和剃毛,不予烧伤,其他4组小鼠给予80℃水浴烫伤20s,造成30%体表面积Ⅲ度烫伤。ITF治疗组依据上述剂量每天分两次口服灌胃给药,B组灌胃等量生理盐水。观察时相为伤后1、3、5、7天,每组每时相6只小鼠。另外比较了纵切剪片法、黏膜刮取法和肠道翻转法三种处理方式分离肠上皮内淋巴细胞(intra epithelial lymphoeyte, IEL)的优劣,最终采用纵切剪片法分离、纯化IEL,并通过流式细胞仪检测TCRγδ+IEL和TCRαβ+IEL细胞比例,分析烧伤后IEL亚型变化规律及ITF对其的影响。 结果:1.体外实验:(1)在烧伤血清的刺激下,B组IEC黏附细菌数量明显高于C组(P<0.01);与B组相比,B+I组和B+M组细菌黏附数量在0.5 h、1 h、明显降低(P<0.05或P<0.01);联合用药的B+I+M组不仅在各时相点明显低于B组(P<0.01),在2 h和3 h明显低于B+I和B+M组(P<0.05或P<0.01)。 (2) rh ITF和黏蛋白能增加烧伤血清刺激后IEC存活率,B+I组在作用1 h和2 h,B+M组在作用0.25 h和0.5 h时,细胞存活率明显高于B组(P<0.05或P<0.01);联合用药效果更佳,B+I+M组不仅明显高于B组(P<0.05或P<0.01),也明显高于另外两组。(3)在烧伤血清刺激下IEC分泌炎性介质(TNF-α、IL-6和IL-8)的能力明显增加(P<0.01)。给予rhITF能显著降低IEC分泌炎性介质的能力,其分泌量明显低于B组(P<0.05或P<0.01);B+M组与B组比较,差异无统计学意义(P>0.05);B+I+M组在各时相点不仅显著低于B组(P<0.01),也明显低于B+I组(P<0.05)。 2.体内实验:(1)通过比较获取细胞数量、纯度和活性以及耗时等4个方面的优劣,明确了纵切剪片法最优,后续实验均采用该方法分离IEL。(2)烧伤后肠道IEL亚型发生明显变化,与C组相比,B组小鼠肠道TCRγδ+IEL比例明显降低,而TCRαβ+IEL比例明显增加(P<0.05)。(3)给予不同剂量的rhITF能增加TCRγδ+IEL比例,同时降低TCRαβ+IEL比例,保持二者的平衡;在烧伤后1-7天都明显优于B组(P<0.05或P<0.01)且应用rhITF的最小有效剂量为1mg/kg。 结论:(1)rh ITF能增强肠上皮细胞抵御细菌黏附的能力,降低细胞死亡率,并能减轻烧伤血清的免疫刺激作用,维护肠上皮细胞免疫稳态,减少炎症介质释放。黏蛋白本身作用较弱,但能显著增强rh ITF作用效果。(2)严重烧伤可导致肠道IEL亚型比例失调,TCRγδ+T细胞比例显著下降,TCRαβ+IEL比例上升,给予rh ITF能维护IEL表型的稳定,有利于维护肠黏膜免疫稳态,其最小有效剂量为1mg/kg。