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外力型脑创伤(inflicted traumatic brain injury)是一种常见的中枢神经系统损伤性疾病,通常发生在婴儿3-6个月龄,具有很高的致死率(10-40%)。近期,据美国健康与人类服务部门报道,外力型脑创伤已经成为婴儿及青少年儿童蓄意性损伤的首位因素,在0-14岁儿童的严重头部损伤中列第三位。患者普遍存在眼科及神经症状,并且超过半数神经预后不佳。早期出现的神经系统问题如大脑性麻痹、智力缺陷、失明、癫痫,长期的随访研究表明头小畸形儿童常常伴有认知和主要的行为学问题。苏格兰一则前瞻性研究报道:通过平均长达59个月的随访发现68%的患儿存在异常发育,36%的患儿存在严重的认知和行动困难,致使他们的生活完全依靠父母和看护者。它给社会及家庭经济方面的影响也是巨大的,治疗费用往往是其他原因造成的颅脑损伤患者的2-3倍。2003年美国在虐待儿童的直接治疗花费上就超过了240亿美元。由于此疾病容易被误诊,报道的发病率往往比真实的发病率低。因此,外力型脑创伤的动物模型,尤其是对旋转加速型脑损伤模型的研究,对于验证新的假说,研究新的病理学机制和干预治疗方案起到至关重要的作用。很不幸的是,这种特殊性创伤性脑损伤的动物模型没有被很好的发展。在此项研究中我们介绍了一种新的动物模型来产生旋转加速损伤。第一部分外力型脑创伤动物模型的建立实验目的:建立外力型脑创伤动物模型实验方法:(1)动物模型建立:建立旋转加速型发育期小鼠脑损伤模型从而模拟临床常见婴幼儿创伤型脑损伤。从每窝抓取偶数个生后12天(P12)的C57BL/6的小鼠,并且按体重配对分为损伤组和对照组。将P12小鼠放入含有3%异氟烷并用100%氧气蒸发的的麻醉盒中,麻醉完毕后把小鼠俯卧位置于平板上,用橡皮筋将头部牢固的固定于头架中,头架被气泵敲击后发生转动,旋转加速的速度和角度可以通过气压和移动活塞的距离来调节,每次造模的过程可以描述为60psi气泵击打活塞60、80、100次,每次旋转的角度为过屈35°过伸25°。在操作结束后统计实验动物的死亡率。(2)意识状态的评估:翻正反射(righting reflex):亦称复位反射。一般指动物处于异常体位时产生的恢复正常体位的反射。动物首先是头部恢复正常位置,这是由于迷路感受引起的,反射中枢在中脑。这时躯干依然处于不正常位置时,就发生颈肌扭曲,于是其刺激就发出使躯干恢复正位的第二反射。采用翻正反射来评估小鼠麻醉后恢复到清醒意识状态的时间。实验结果:(1)与SHAM组相比,在60psi下无论是60、80或100次旋转加速过程中,i TBI组小鼠均出现了呼吸暂停,口唇粘膜发绀的缺氧现象,在100次旋转加速操作后i TBI组小鼠的生存率达79%。(2)翻正反射结果显示:SHAM组小鼠从麻醉状态恢复到清醒意识的平均时间为83秒,在60psi下在60、80和100次旋转加速后i TBI组小鼠从麻醉状态恢复到清醒意识的平均时间分别为181±43.1秒、266±23.8秒、328±35.7秒,呈阶梯状递增。结论:本研究成功建立了旋转加速型发育期小鼠外力型脑损伤模型。第二部分发育期小鼠外力型脑创伤后的生理学及神经病理学改变实验目的:探讨发育期小鼠在外力型脑创后的神经病理学及生理学改变实验方法:(1)生命体征检测:完成旋转加速操作后的小鼠置于俯卧位,将感应器夹在小鼠大腿跟部,由Mouse Ox TM Oximeter(STARR Life Sci.Corp.)监测损伤后动物的心肺功能和血氧饱和度,并由计算机模拟数据系统与Win Daq数据获取系统连接进行数据采集。(2)脑损伤评估:损伤后的小鼠去顶骨后,肉眼观察其硬脑膜及蛛网膜下是否发生出血或水肿;通过Evans Blue法测量血脑屏障渗透性;通过测量大脑的湿/干比重从而确认损伤后的脑水肿情况。实验结果:(1)生命体征检测:在60psi,60次旋转加速的致伤作用下,所有i TBI组小鼠均出现了不规则的呼吸,一些出现了中枢性呼吸暂停。与SHAM组小鼠相比,i TBI组小鼠的呼吸频率、心率、血氧饱和度受到了严重的影响。(2)i TBI组小鼠在不同的致伤条件作用下(15psi,30次;30psi,30次;60psi,30次;60psi,60次;60psi,100次)硬脑膜及蛛网膜下均可肉眼观察到出血症状;在60psi,60次的致伤作用下,损伤7小时后,与SHAM相比,在610nm波长处i TBI组鼠脑中Evans Blue溶液质量增加,存在显著差异(P<0.05,n=5),表明了血脑屏障的通透性增高;在60psi,60次的致伤作用下,损伤7小时后,i TBI组小鼠脑的湿/干比5.05±0.24g/g,SHAM组小鼠脑的湿/干比4.74±0.15g/g,差别具有显著的统计学意义(P<0.05,n=5),表明了损伤7小时后急性脑水肿的发生。结论:外力型脑创伤可导致小鼠出现短暂的心肺功能失常及生命体征变化,包括心动过缓、出现呼吸暂停症状,血氧饱和度下降;血脑屏障完整性发生破坏,脑间质渗透性增强,并出现脑水肿。第三部分发育期小鼠外力型脑创伤的行为学变化实验目的:探讨发育期小鼠在外力型脑创后是否发生运动和认知能力的改变实验方法:(1)动物行为学测试:采用旋转棒实验法(Rotarod test)分别在伤后不同的观察点(伤后9天、19天、30天)对脑损伤后雄性小鼠进行神经功能评价,以观察脑损伤后小鼠运动功能及协调性的恢复情况;采用Y迷宫实验(Y maze test)分别在不同的观察点(伤后14天、21天、28天)对脑损伤后小鼠进行神经功能评价,以观察脑损伤后小鼠辨别性学习和记忆能力的恢复情况。(2)分子表达:动物模型完成后(60psi,60次)在伤后第3天(3dpi)收集,SHAM组/i TBI组新鲜脑组织,应用蛋白定量分析法观察胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及白细胞介素-6(IL-6)、小胶质细胞特异性抗体Aba I表达情况,以观察促炎介质及星形胶质细胞反应对早期动物行为学的影响。(3)神经元损伤评估:动物模型完成后(60psi,60次)在伤后第42天(42dpi)收集,SHAM组/i TBI组脑组织固定于4%多聚甲醛中,通过20%蔗糖脱水、冰冻包埋处理后,进行冰冻切片并浸于4%多聚甲醛中7天后进行脑片银染,在形态学上观察神经元损伤对远期动物行为学的影响。实验结果:(1)两组动物的旋转棒实验法(Rotarod test)结果显示:从伤后第9天至伤后第30天两组动物的评分值呈逐步上升趋势。伤后第9天,SHAM组/i TBI组=81.37s/50.16s,差别具有显著的统计学意义(P<0.05),伤后第19天,SHAM组/i TBI组=109.12s/129.2s,差别无显著的统计学意义,伤后第30天,SHAM组/i TBI组=120.36s/148.96s,差别无显著的统计学意义;Y迷宫实验(Y maze test)结果显示:从伤后第14天到伤后第28天,SHAM组评分值无明显差异,i TBI组在伤后第28天评分值明显下降,伤后第14天,SHAM组/i TBI组=0.59/0.58,伤后第21天,SHAM组/i TBI组=0.55/0.6,伤后第28天,SHAM组/i TBI组=0.56/0.41,差别具有显著的统计学意义(P<0.05)。(2)Western blot结果显示:伤后第3天,i TBI组小鼠脑组织中胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及白细胞介素-6(IL-6)、小胶质细胞特异性抗体Aba I水平出现明显升高,和SHAM相比差别具有显著的差异(P<0.05)。(3)银染结果显示:伤后第30天,i TBI组小鼠脑组织第一运动皮质区(M1区)第一前肢功能躯体感觉皮质区(S1FL区),及基底前脑(BF区)出现黑色点状染色,提示这些区域的神经元胞体及轴突的退行性变。结论:外力型脑创伤对小鼠发育未成年时期运动功能及协调性具有显著的影响,但在发育后期已接近正常水平。尽管如此,对于探知功能的影响则出现在发育成年阶段,综上结果表明了外力型脑创伤可以导致发育期小鼠大脑的运动功能、协调性和辨别性学习和记忆能力缺陷;并且可导致发育期小鼠损伤早期的炎症反应、小胶质细胞、星形胶质细胞增生及发育后期神经退行性变,这可能也是导致小鼠功能发生变化的主要因素。