研究背景与意义结直肠癌(Colorectal carcinoma, CRC)是人类最常见的三大肿瘤之一,肝脏是CRC最常见的转移部位,肝转移是导致大约2/3CRC患者死亡的主要原因。在疾病整个发展过程中,有一半以上的结直肠癌患者会发生肝转移。转移是结直肠患者治疗后复发和预后不良的主要原因。因此,如何控制转移和复发是临床上提高肿瘤患者的生存期,延长生命的一个关键因素。结直肠癌的转移是一个多因素、多步骤的复杂过程,受多种因素的调控。肿瘤的转移是肿瘤细胞与转移靶器官微环境相互作用的结果。肿瘤细胞从原发部位脱落,进入血管和/或淋巴管,然后在循环中生存、粘附于继发器官微血管、再渗出血管和/或淋巴管、进入特定的器官组织,最后在特定部位形成微转移瘤。在这个过程中,并不是所有进入血液循环的肿瘤细胞都能到达特定的靶器官,形成转移瘤,只有极少一部分细胞能够形成转移瘤。随着肿瘤干细胞(cancer stem cell, CSC)的发现和确认,人们逐渐认识到,CSC是肿瘤发生发展的根源,是肿瘤形成的种子。但是,并非所有的CSC都能够引起转移,形成转移瘤。随着研究的深入,人们发现,只有极小部分的CSC细胞具有转移侵袭能力,这部分CSC除了具有普通肿瘤干细胞的自我更新、分化增殖能力以外,更重要的是它们具有侵袭转移能力,能够在特定的器官形成转移瘤,这部分肿瘤干细胞被称之为转移性肿瘤干细胞(metastasis cancer stem cell, MCSC)。随着MCSC的成功分离和鉴定,人们普遍认为,MCSC是肿瘤转移的根源。CSC/MCSC要在特定器官形成转移瘤,CSC作为转移的种子是首要的必备条件,但如果只有单纯的CSC,转移仍是不可能发生。CSC/MCSC从原发部位脱落,进入到循环系统,经过血管内皮细胞的迁移和组织浸润,最后到达特定的靶器官,最终在远处的形成转移瘤。在这个复杂的过程中,每一步都离不开CSC/MCSC所生活的微环境。CSC/MCSC要与其生活的微环境相适应,才能够形成转移,也就是说“种子”只有在遇到了合适的“土壤”才能够最终在那里定植,然后自我更新、分化增殖形成新的转移瘤。这个CSC/MCSC所生活的微环境被称为“niche",包括肿瘤原发部位生存的环境以及转移靶器官的微环境,构成这些微环境的成分主要包括内皮细胞、炎症细胞、成纤维细胞、脂肪细胞及神经细胞等支持细胞及所产生的细胞因子,这些成分构成CSC/MCSC赖以生存的微环境。在这个微环境中,这些成分共同支持着CSC/MCSC的特性,内皮细胞与CSC/MCSC相互作用能够维持CSC/MCSC的自我更新能力。上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)被认为在肿瘤的侵袭和转移中发挥着关键作用。例如,CSC的EMT,既能维持CSC/MCSC的干性也能够促进CSC/MCSC的远处转移。这说明,肿瘤细胞生活的微环境对CSC/MCSC的存活、肿瘤的侵袭转移起到了重要的调控作用。也有研究认为,微血管内皮细胞肿瘤细胞相互作用决定了器官转移的特异性。肿瘤转移的器官特异性可能与肿瘤细胞和组织微血管的内皮细胞选择性粘附有关。最新的研究证明,肿瘤的侵袭转移依赖于肿瘤细胞首先获得EMT的特征,这些特征包括肿瘤细胞失去极性,与周围细胞外基质接触减少,肿瘤细胞与原发部位的粘附能力下降,迁移和运动能力增加等有关。通过对这些CSC生长分化的微环境研究显示：阻断CSC/MCSC与微环境的相互作用,降低与内皮细胞的粘附能力,逆转其EMT的改变,可能是未来抗肿瘤转移治疗的新方向。在我们课题组前期的研究中,利用有限稀释法,从人结直肠癌细胞系SW480中获得结直肠癌CSC样克隆,又通过动物模型验证筛选出来结直肠癌转移干细胞(MCSC)和非转移性干细胞(non-metastatic cancer stem cell, nMCSC),本研究采用免疫磁珠分选法,从裸鼠的肝脏分离出了高纯度的肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cell, LSEC),通过免疫细胞化学方法,确定了分离出的细胞的纯度,免疫荧光检测分选细胞的凋亡状态及体外培养存活时间。结直肠癌细胞、不同转移潜能的CSC与鼠肝窦内皮细胞共培养,应用Transwell实验、荧光共聚焦显微镜检验,发现不同肿瘤细胞与鼠肝窦内皮细胞的粘附能力不同。最后,我们把共培养后肝窦内皮细胞／肿瘤细胞与单独培养的肿瘤细胞行裸鼠皮下移植、盲肠原位移植转移实验验证,发现肝窦内皮细胞与不同特性的肿瘤细胞共培养后,促进肿瘤细胞的EMT改变,明显提高了结直肠癌细胞尤其是CSC的侵袭和转移,肿瘤转移更早,更广泛。阻断CSC与转移靶器官血管内皮的相互作用,可能有效阻断结直肠癌的转移,建立抗转移治疗新策略。方法1裸鼠肝窦内皮细胞的分离、培养和鉴定。应用免疫磁珠分选裸鼠肝窦内皮细胞,抗小鼠CD146免疫磁珠作为裸鼠肝窦内皮细胞的表面标记物,结合IV型胶原酶消化法,在磁场中利用分离分析柱得到了CD146阳性细胞。流式细胞检测分选前后CD146阳性细胞的比例。经过内皮细胞的表面标记物兔抗鼠Ⅷ因子相关抗体(Factor8)标记检测,确定分选后的细胞表达Factor8的阳性率。Hochest33342/PI双染试剂盒测定了分选后LSEC体外培养的动态生长状态与凋亡状态。2不同转移潜能的结直肠癌细胞与鼠肝窦内皮细胞共培养后的粘附情况把新鲜分选的鼠LSEC分别与结直肠癌细胞系SW480、MCSC、nMCSC同等数量级细胞(106)放在培养皿共培养,Transwell小室跨膜侵袭实验比较观察肿瘤细胞的侵袭能力及其与LSEC的粘附情况,计数不同肿瘤细胞与肝窦内皮细胞粘附的数量以推断其粘附能力。激光共聚焦显微镜观察结直肠癌细胞系SW480、MCS、nMCSC与LSEC细胞的粘附形态与粘附关系。3不同转移潜能的结直肠癌细胞与鼠肝窦内皮细胞共培养后裸鼠皮下成瘤能力、盲肠原位移植后转移能力的比较。不同转移潜能的结直肠癌细胞与LSEC培养后裸鼠皮下接种,动态观察成瘤状态、绘制肿瘤团块生长曲线。等到皮下瘤直径8～10mm时,无菌下取出瘤块,放入冰浴中的无血清RPMI-1640培养基中,瘤组织剪成1mm3的小块备用。取6只4-5周龄的BALB/c-nu裸鼠,用1%的戊巴比妥(1ml/kg)将其麻醉后,左下腹切口,用镊子拖出盲肠,刮除少许浆膜组织,用7/0带线缝合针将体积为1mm3的瘤块荷包式缝合于损伤的浆膜处,将盲肠送回腹腔,缝合腹壁切口。38天后,裸鼠出现明显恶病质,处死裸鼠,常规对裸鼠各脏器取材,制作石蜡切片、HE染色,确定肿瘤的转移情况。结果1.通过免疫磁珠分选,我们得到了纯度较高的鼠LSEC,经过免疫细胞化学法检测Ⅷ因子的表达,阳性细胞数达95.0±0.4%。流式细胞检测显示分选后CD146阳性标记细胞显著高于分选前。通过Hochest33342/PI双染试剂盒检测,发现LSEC在体外培养的第3、5、7、10天,并不发生明显凋亡。倒置显微镜下观察体外培养的LSEC成半贴壁状态,呈典型的鹅卵石样分布,可在体外有效存活3周,细胞形态并不随培养时间而改变。2.新鲜分选的鼠LSEC与SW480、MCSC、nMCSC二维共培养,在20倍显微镜先计数每个视野肿瘤细胞上粘附的LSECs,计数三个视野取平均值。结果如下：SW480为95.667±6.028、MCSC为160.33±7.37、nMCSC为76.67±10.12。统计分析3种细胞与LSEC的粘附具有差异性(F=89.712,P<0.001),说明MCSC与LSEC的粘附能力最强,SW480次之,nMCSCs最弱。Transwell小室上层分别放SW480、MCS、nMCSC,下室铺LSEC,瘤细胞穿膜能力及进入下室后与LSEC的粘附能力与前类似。免疫荧光共聚焦显微镜检测结果与前面吻合。3.不同转移潜能的结直肠癌细胞与LSCE细胞共培养后裸鼠皮下接种观察,测量瘤块生长直径,计算肿瘤体积。用Bonferroni两两比较结果显示,从第7天起,单独培养SW480细胞与MCSC、nMCSC细胞皮下瘤生长能力开始出现显著差异(P<0.05),而MCSC和nMCSC组细胞皮下瘤生长能力无显著学意义(P>0.05)；三组不同转移潜能的结直肠癌细胞与LSEC共培养后皮下瘤生长能力与上述三组结果相似。不同转移潜能的结直肠癌细胞共培养前后两组间比较：SW480和SW480/LSEC共培养细胞、MCSC和MCSC/LSEC共培养细胞、nMCSC和nMCSC/LSEC共培养细胞皮下成瘤能力均无统计学意义(P>0.05)。统计学结果表明：6组细胞皮下瘤体积的总体差异具有显著性(F=147.125,P=0.000)；每组细胞皮下瘤体积随着时间的延长逐渐长大,不同时间点肿瘤体积的大小差异具有统计学意义(F=51.066,P=0.000)；细胞与天数间有交互效应具有统计学意义(F=5.792,P=0.000)；随后的盲肠原位移植实验发现,不同转移潜能的结直肠癌细胞与LSEC共培养后,促进了肿瘤细胞的EMT改变,侵袭能力明显增强,肿瘤转移更广泛。4.肿瘤细胞发生梭形细胞转化,LSEC可能促进结直肠癌CSC发生EMT样转变,从而促进肿瘤转移。盲肠原位移植实验观察发现,肿瘤细胞发生梭形细胞转化,在SW480/LSEC、MCSC/LSEC和nMCSC/LSEC三组盲肠原发瘤均出现此现象,而相应单一细胞移植裸鼠不出现瘤细胞的梭形细胞转化。肿瘤细胞的梭形细胞转化特性意味着肉瘤样改变,产生EMT特性,在MCSC/LSEC组移植鼠表现更明显。MCSC发生EMT转化,可能是肿瘤转移早、转移结节形成数量多的主要原因。结论1采用免疫磁珠法分选LSEC,可以获得较高纯度的LSEC,得到的细胞活力好,体外培养存活时间长,体外培养细胞形态及表型特征稳定。2不同转移潜能的结直肠癌细胞与肝窦内皮细胞具有不同的粘附能力,转移性的结直肠癌CSC更易粘附LSEC。3LSEC并不改变结直肠癌SW480细胞、结直肠癌CSC裸鼠皮下成瘤能力,但能增强结直肠癌CSC的转移能力。LSEC可能促进原位肿瘤发生EMT转变而增强肿瘤细胞的侵袭转移特性,肿瘤转移更早、更广泛。本研究创新之处1.免疫磁珠分选肝窦内皮细胞简单可靠,,值得推广。2.转移性的结直肠癌CSC更易与LSEC粘附,有利于肿瘤侵袭转移。3.靶器官血管内皮细胞促进结直肠癌CSC的侵袭和转移可能通过促进CSC的EMT转变来实现的。