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目的: 1.分离提取出足量、稳定的大鼠骨髓源内皮祖细胞(EPCs),为进一步探索黄芪、丹参、当归含药血清配伍及单味药对EPCs生物学功能的影响做准备; 2.从体外细胞实验角度,明确黄芪丹参配伍含药血清对大鼠骨髓源EPCs增殖、迁移、黏附和形成管状结构功能的影响,为黄芪丹参配伍使用以及益气活血法的应用提供理论依据,也为进一步阐明益气活血法对EPCs参与血管新生作用的影响机制研究提供参考。 方法: 1.EPCs的分离、培养 采用密度梯度离心法从大鼠骨髓中分离出单个核细胞,然后用差速贴壁法纯化细胞。用加入了多种细胞因子的EGM-2培养液诱导培养,置于5%CO2、37℃、饱和湿度的培养箱中孵育。实验过程中所用细胞为培养7天的原代细胞。 2.EPCs的鉴定 (1)形态学观察:倒置相差显微镜下观察细胞的形态及生长状态。 (2)细胞表型鉴定:取培养7天的原代细胞,用流式细胞仪鉴定细胞表面抗原CD34、CD133和VEGFR-2。一抗分别为羊抗大鼠CD34抗体、兔抗大鼠CD133抗体和兔抗大鼠VEGFR-2抗体,二抗分别为FITC标记的羊抗兔IgG和兔抗羊IgG。 3.制备含药血清及实验分组 将中药饮片浸泡、煎煮、过滤并浓缩至预定浓度后灭菌备用,用灌胃法给大鼠给药,每日两次,连续给药4天后通过心脏取血,分离出含药血清灭活除菌。实验分为6个组:黄芪组、丹参组、当归组、黄芪丹参配伍组、黄芪当归配伍组及空白对照组。 4.EPCs功能的检测 (1)EPCs增殖功能的检测:消化收集培养7天生长良好的原代细胞,以2.5×103个/孔接种于96孔培养板中,待细胞贴壁后加入含药血清培养,分别在含药血清作用24小时、48小时、72小时时采用MTT比色法检测细胞的增殖情况。 (2)EPCs迁移功能的检测:用Transwell小室法进行迁移实验,下室分别加入含药血清,上室分别以5×104个/孔接种培养7天生长良好的原代细胞,含药血清作用24小时后用结晶紫将迁移过膜的细胞进行染色,倒置显微镜下观察迁移细胞数量并拍照。 (3)EPCs黏附功能的检测:用基质胶制备人工基底膜,将培养7天生长良好的原代细胞以4×103个/孔接种于铺有人工基底膜胶的96孔培养板上培养,含药血清作用6小时后洗去未黏附细胞,用MTT法检测各组黏附细胞量。 (4)EPCs管状结构形成功能的检测:将培养7天生长良好的原代细胞以2×105个/孔接种于提前铺入Matrigel胶的24孔培养板上,含药血清作用6小时后,倒置显微镜下观察各组细胞的管状结构形成情况并拍照,用image J测量管状结构长度。 5.统计学处理 实验数据采用SPSS17.0统计分析软件进行单因素方差分析,P﹤0.05为差异有统计学意义。 结果: 1.EPCs的培养与鉴定 分离培养24小时后的原代细胞大部分呈小圆形,尚未贴壁;培养3天后,EPCs均已贴壁,多为梭形或纺锤形;培养4天后贴壁细胞数量增多,细胞开始明显增殖;培养7天后可见大量细胞集落形成,细胞增殖旺盛;培养10天到14天后细胞集落逐渐融合成片,呈典型的铺路石样形态。原代培养7天的EPCs表面抗原CD34表达率为39.51%,CD133表达率为23.75%,VEGFR-2表达率为17.75%,表明所分离培养的细胞为EPCs。 2.各组含药血清对EPCs功能的影响 (1)各组含药血清对EPCs增殖功能的影响 含药血清处理细胞24小时后检测结果显示,黄芪丹参配伍组细胞增殖能力最强,与黄芪组、丹参组、当归组、空白对照组相比差异有统计意义(P﹤0.05);药物作用48小时、72小时后检测结果显示,黄芪丹参配伍组细胞增殖能力最强,与其它各组相比差异均具有统计意义(P﹤0.05)。 (2)各组含药血清对EPCs迁移功能的影响 含药血清处理细胞24小时后结果显示,黄芪丹参配伍组迁移过膜的细胞个数最多,与黄芪组、丹参组、当归组、黄芪当归配伍组和空白对照组相比,差异均具有统计意义(P﹤0.05)。 (3)各组含药血清对EPCs黏附功能的影响 含药血清处理细胞6小时后检测结果显示,黄芪丹参配伍组黏附细胞数量最多,与黄芪组、丹参组、当归组和空白对照组相比,差异均具有统计意义(P﹤0.05)。 (4)各组含药血清对EPCs管状结构形成功能的影响 含药血清处理细胞6小时后结果显示,黄芪丹参配伍组形成管状结构长度最长,与黄芪组、丹参组、当归组、空白对照组相比,差异均具有统计意义(P﹤0.05)。 结论: 1.体外培养大鼠骨髓源性EPCs具有增殖、迁移、黏附和形成管状结构的功能; 2.黄芪、丹参、当归、黄芪丹参配伍、黄芪当归配伍含药血清均具有改善体外培养骨髓源性EPCs的增殖、迁移、黏附和管状结构形成能力的作用; 3.黄芪丹参配伍含药血清比黄芪、丹参、当归单味药和黄芪当归配伍含药血清能更显著的提高EPCs的增殖、迁移、黏附和管状结构形成能力,黄芪和丹参中的某些活性成分在提高 EPCs生物学功能的过程中可能具有协同作用,益气活血法对改善 EPCs的生物学功能具有重要作用。