龋病是口腔最常见的疾病,严重影响人类的口腔乃至全身健康,并且随着年龄的增长,其患病率和发病率都呈现上升的趋势,因此一直是国内外学者研究的热点。龋病是在以细菌为主的多种因素影响下,牙齿硬组织发生慢性进行性破坏的一种疾病。长期以来,人们认为龋病是一个脱矿为主的病变,其发生发展的过程是不可逆的,牙齿内的矿物质是永久性丢失,最终形成了龋洞。而现代龋病学理论认为：龋病的发生是一个脱矿与再矿化不断交替变化的过程。再矿化是溶液中的钙磷等离子重新沉积到部分溶解的晶体表面并诱导其重新增长的过程,它不但可以维持牙釉质内矿物质丢失与获得之间的动态平衡,而且还能促进龋损的自然修复或使其愈合。氟是目前最有效的阻止牙体组织脱矿,促进其再矿化的材料。尽管氟的防龋功效已得到大量的研究证明,但是过度使用氟化物也带来了副作用,如氟斑牙、氟骨症等。因此,在研究提高氟化物利用的同时,仍然有必要继续探索其他有效的非氟防龋药物。羟基磷灰石(hydroxyapatite, HA)是牙齿硬组织的主要无机成分,因其具有良好的生物相容性和生物活性,近年来是生物材料研究的热点之一。随着纳米材料在吸附、光学、磁性、催化及化学活性等方面性能研究的深入,对HA的研究也进入了探索应用纳米羟基磷灰石(nano-hydroxyapatite, n-HA)性能的新阶段。基于n-HA具有和人类牙齿近似的微晶结构,近年来有初步报道n-HA对牙齿的功效研究,表明其在早期釉质龋再矿化、缓解牙本质敏感及美白等方面有较好的效果。由于比表面积大、颗粒表面原子数多,n-HA具有较高的表面能、高静电场等特性,可增加Ca2+的迁移,促进脱矿区的再矿化。另一方面,在环境功能矿物材料研究领域,n-HA作为一种无机材料,又是用来治理土壤污染及水污染的重要环境功能材料。随着世界经济的快速发展,包括水、空气、土壤等的污染已成为许多国家所面临且迫切需要解决的重大环境问题。重金属是水的主要污染源之一。重金属离子在自然环境中不能被生物降解,且具有生物累积性和富集性。当重金属摄入人体后,会和生物高分子发生相互作用而使它们失去活性,引起器官的病变；又由于重金属的生物累积性,会造成慢性累积性中毒。近年来媒体披露的重金属污染事件屡见不鲜,特别是我国绝大多数城市缺乏污水排放和集中处理设施,导致大量生活污水未经处理就直接排入水体造成环境污染。因此,防治重金属水污染刻不容缓!近年来大量研究显示n-HA具有强大的吸附能力,对污染的水质或土壤中的重金属离子有良好的吸附去除效果,是一种优异的吸附剂。基于HA在口腔保健用品和吸附重金属离子中的作用,本课题组研究在牙膏中添加HA。一方面发挥其口腔保健功效,另一方面,在刷牙后,少量牙膏残留于口腔,绝大多数牙膏废液流入下水道,又可发挥HA吸附生活废水中重金属离子的作用,并由此在国际上率先提出“环保型功效牙膏”概念,且在前期研究中初步验证了其可行性,从而为人们的刷牙行为赋予了环保意义,因此本研究具有重要的环保价值。以往大多数研究的是单一粒径的HA的再矿化作用,缺乏对不同粒径HA的再矿化效果的比较研究。单纯HA和掺HA牙膏对重金属离子吸附效果的比较研究未见报道。且随着纳米粒径的减少,其吸附性能是否更好?目的采用柠檬酸酸蚀牙釉质,扫描电镜观察釉质表面脱矿不同时间后的形态学特征,获得研究早期釉质龋的实验模型,为下一步的研究提供更接近自然龋损的化学脱矿实验方法。在建立早期釉质龋的基础上,通过体外pH循环实验,模拟口腔内环境,采用显微硬度仪及扫描电镜研究不同粒径HA对早期釉质龋的再矿化作用,进一步探讨其防龋机制。比较不同粒径HA及其牙膏分别对模拟废水中镉离子及铜离子的吸附能力,同时研究掺HA牙膏对重金属离子吸附的稳定性及作用机制。方法(1)选取因正畸治疗而拔除的人恒前磨牙,要求牙齿无白垩斑、无龋坏、无裂纹或其他缺损。使用金刚砂车针,在冷水冷却下将牙冠切割制成釉质块,将釉质表面抛光。自然干燥后用显微硬度仪(Knoop压头,10g,15s)测量基线表面显微硬度(surface microhardness, SMH),选择硬度值范围为305～355 KHN (Knoop hardness number,努氏硬度值)釉质块,釉质块表面开窗,面积约为4mm×4mm大小,其余部位涂布2层抗酸指甲油,自凝树脂包埋。选取30个釉质块,随机分为3组,每组10个样本。将每组样本置于100 mL10%的柠檬酸溶液中,酸蚀时间分别为90 s、120 s、150 s,去除柠檬酸溶液,再置于去离子水中超声波清洗。从各组随机抽取5个标本作为扫描电镜(SEM)观察用。将各标本按组编号,去离子水冲洗后,置于干燥箱中干燥。进行SEM观察(每个标本随机选取3个不同区域),并在不同放大倍数下(×10000、×30000、×60 000)拍摄电镜图像并存储。(2)将上述制备好的釉质块样本放入10%的柠檬酸溶液中酸蚀120s,去除柠檬酸溶液,在釉质块上形成人工龋。测量脱矿后人工龋表面显微硬度,选择硬度值范围为155～185 KHN釉质块60个用于pH循环实验。本实验将60个人工釉质龋样本随机分为6组(即10个/组)：NaF组(阳性对照)：氟浓度为1g/L的氟化钠溶液；DDW组(阴性对照)：去离子水；20 nm HA组；30 nm HA组；60 nm HA组和12 μm HA组。采用体外pH循环流程,在37℃恒温水浴箱中持续处理12 d。每天的pH循环包括：实验组处理4次,每次处理3 min,放入脱矿液中浸泡2 h,其余时间浸泡在再矿化溶液中。上述所用溶液均为每天新鲜配置。SEM观察正常釉质、脱矿后及再矿化后形貌。从各组随机抽取5个标本,每个标本随机选取3个不同区域进行扫描电镜观察,并在不同放大倍数下(×10000、×30000、×60000)拍摄电镜图像并存储。各组另外5个标本,在各釉质块窗口再次测量表面显微硬度,然后对脱矿前、脱矿后及pH循环后测得的所有5个硬度值的平均值进行比较,并计算出表面显微硬度恢复的百分比(%SMHR)。采用16.0版SPSS统计软件包进行统计分析,选用配对t检验比较再矿化前后的显微硬度值,选用单因素方差分析及其两两比较来比较各组表面显微硬度恢复的百分比。(3)将20 nm HA、30 nm HA、60 nm HA、12 μm HA粉末分别配成4组系列浓度的HA悬液,再取上述HA悬液1 mL分别加入50 mL镉、铜离子溶液中。静置反应1d后,离心、过滤,取上清液用电感藕合等离子发射光谱仪(Inductively coupled plasma emission spectrometer, ICP)测定剩余镉、铜离子的浓度,计算吸附率。将掺20 nm HA、30 nm HA、60 nm HA、12 μm HA牙膏及空白牙膏分别配成5组系列浓度的牙膏悬液,取上述牙膏悬液1 mL分别加入50 mL镉、铜离子溶液中。静置反应1d后,离心、过滤,取上清液用ICP测定剩余镉、铜离子的浓度,计算吸附率。重复上述方法配置反应体系,静置14 d、28 d,再次测量残余镉、铜离子浓度,并计算吸附率。结果(1>对牙釉质进行脱矿处理后,釉质表面呈现明显的酸蚀状外观,呈典型的蜂窝状、多孔隙的缺损。酸蚀时间为90 s时,釉质表面的孔状结构增多、加深且形态不规则,高倍镜下(×30000)见孔状结构附近的釉质表面粗糙,仅见小部分釉柱晶格脱矿溶解,脱矿能力有限。继续酸蚀至120 s,低倍镜下呈典型的鱼鳞状,头部溶解脱矿,逐步向尾部扩展,边界清晰,形成中央较浅的凹陷区域；高倍镜下,釉柱排列不紧密,比较疏松,原有的釉柱结构部分消失,可见微孔和明显的釉柱端凹陷,同时周围不规则的多孔状结构增多,蜂窝状结构明显。酸蚀处理至150s时,牙釉质表面呈现明显的腐蚀状形貌,晶体中央溶解造成晶体中心区穿孔,晶体溶解区不断扩大,相邻晶体的穿孔溶解区相互融合,形成大面积的晶体结构崩解区。(2>实验各组均能提高脱矿釉质的表面显微硬度(P<0.05),各组间pH循环前后釉质表面显微硬度的提高有显著不同,通过方差分析及两两比较得到,纳米级HA明显优于微米级HA,20 nm HA组显微硬度恢复的百分比为70.5%,高于30 nm HA组(64.3%),但差异无统计学意义(P>0.05),其余各组之间表面显微硬度恢复的百分比都具有统计学意义(P<0.05),其中NaF组硬度恢复的百分比最高达81.8%,DDW组最低为16.9%。纳米HA组矿化后的釉质表面外观比氟化物组,更加规则、均匀,高倍镜下,进一步观察在脱矿面上可见均匀密集的,有许多针状或短棒状的晶体颗粒沉积封闭,与正常釉质结构镶嵌紧密。蜂窝结构消失,少见或不见釉面脱矿孔隙,20 nm HA组和30 nm HA组未见明显差别。60 nm HA组稍欠均匀平整,有少数脱矿孔区可见。12 μm HA组：釉质表面仅有小部分沉积物形成,低倍镜下可见大颗粒悬浮于表面,高倍镜下其外观与DDW组相似,且因晶体粒度大,不能进入脱矿釉质深层,仍有部分蜂窝状结构可见。(3>不同粒径HA对模拟废水中的镉离子具备较强的吸附能力,其吸附率随着HA悬液浓度的增加而升高,平均吸附率达80%左右,纳米级HA的吸附能力优于微米级。不同粒径HA牙膏对模拟废水中的镉离子具备一定的吸附能力,其吸附率也随着HA悬液浓度的增加而升高,但平均吸附率比单纯HA降低了19%左右,掺HA牙膏组的吸附能力均高于空白牙膏组。掺20 nm HA和掺30 nmHA牙膏组对镉离子的吸附效果较为稳定,随时间的推移吸附率未出现解吸附现象。HA吸附镉离子的可能机制为离子交换、溶解-沉淀、表面络合等化学反应过程。不同粒径的HA及其牙膏对模拟生活废水的铜离子均具有良好的吸附能力,并随着其浓度增加而增大,且掺入牙膏后吸附能力增强,均以粒径20 nm HA的吸附能力最大。HA及其牙膏对铜离子的吸附效果都比较稳定,没有出现解吸附现象。HA对铜离子的去除机制可能是离子交换吸附为主并有物理吸附的作用。掺HA牙膏悬液对铜离子的去除可能是离子交换吸附协同物理吸附作用。本研究得出,随着HA悬液或牙膏悬液浓度的增加,其对镉、铜离子的吸附能力逐渐下降。通过对HA悬液及其牙膏悬液的吸附能力倍数与其浓度倒数倍数进行线性拟合,首次发现HA和牙膏悬液的吸附能力倍数与其浓度倒数倍数呈良好的线性相关关系。因此,作为吸附剂来吸附生活污水中的重金属离子,HA的浓度不是越高越好,推测HA的浓度增大后,可能影响其表面的结合位点。结论(1>首次运用柠檬酸溶液对牙釉质进行酸蚀,采用扫描电镜进行观察不同时间脱矿后的表面形貌,结果表明10%的柠檬酸溶液脱矿牙釉质120 s,可获得高效、可靠早期人工釉质龋模型。(2>n-HA对早期牙釉质龋有较好的再矿化作用,能显著提高早期人工釉质龋的表面显微硬度,以20 nm HA的效果最好。(3)HA及掺入牙膏后都对镉离子具有较强的吸附作用,掺入牙膏后其吸附率有所下降。HA及掺入牙膏后都对铜离子具有较强的吸附作用,掺入牙膏后其吸附率明显提高,其中以20 nm HA及掺20 nm HA牙膏后的吸附能力最佳。首次发现HA和牙膏悬液对镉、铜离子的吸附能力倍数与其浓度倒数倍数呈良好的线性相关关系。