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研究目的：醛固酮在调节细胞外液，维持电解质平衡以及控制血压稳定的过程中发挥着重要的作用，醛固酮重要的生理功能有赖于通过调控肾上皮钠通道（ENaC）对钠的重吸收，目前已知相关的作用机制分为基因组作用和非基因组作用。其中，研究较清楚的是醛固酮的基因组作用方式：醛固酮进入集合管主细胞后，与胞浆内的盐皮质激素受体(mineralocorticoid receptor，MR)结合，形成激素-受体复合体，后者进入细胞核与核中DNA特异性结合位点相互作用，调节特异性mRNA转录，最终合成多种醛固酮诱导蛋白(aldosterone-induced protein, AIP)，使管腔膜(apicalside)ENaC活性增强，基侧膜(basolateral side)钠钾泵的活性增加，从而促进跨上皮细胞的Na＋重吸收。醛固酮基因组作用的特点是作用起效较慢，作用时间长，对MR阻断剂敏感。此外,醛固酮还可发挥快速的非基因组作用来调控Na+的重吸收，此作用的特点为起效迅速,对MR阻断剂不敏感,但其内在机制还知之甚少。因此研究醛固酮非依赖MR快速调控ENaC的作用及其相关的作用机制，有助于进一步全面了解醛固酮调节ENaC作用的生理、病理意义，同时也可促进新型醛固酮拮抗药物的研发，为醛固酮快速作用提供可能的应对措施。主要内容：1建立具有ENaC活性的哺乳动物肾上皮细胞模型并进行评价。2研究醛固酮快速调控ENaC的作用。3探讨醛固酮快速调控ENaC的可能机制。研究方法：1．实验细胞模型的建立建立具有ENaC活性的哺乳动物肾上皮细胞模型-选择MDCK（Madin-Darbycanine kidney）、mpkCCD（mouse principle cell of kidney in cortical collecting duct）两种细胞株，培养成具有完整膜，有极性，高阻抗，阿米洛利敏感的细胞模型,最后通过观察细胞形态结构、测量跨膜电阻值、测量细胞单通道记录三个方面来评估，择优选出适合进一步实验的理想细胞模型。2．醛固酮对ENaC的快速调控作用给予醛固酮(10-6M/L)作用于mpkCCD细胞模型，观察醛固酮对细胞形态结构、阿米洛利敏感的跨膜电阻、胞内钙离子浓度、单通道离子电流的影响。使用MR阻断剂螺内酯以及醛固酮转录、蛋白合成抑制剂，验证醛固酮对ENaC快速（＜3小时）调节作用主要是非依赖MR的非基因组作用。3．醛固酮对ENaC作用机制的研究（1）通过使用PI3-K通路特异性的阻断剂LY294002(50um/L)验证PI3-K通路在醛固酮快速调控ENaC过程中的作用。（2）通过使用钙离子载体A23187（1um/L）快速增加胞内钙离子浓度来探讨胞内钙离子在醛固酮调控快速调控ENaC过程中的作用。（3）通过使用细胞松弛素D(Cyt D)打断细胞骨架F-actin,探讨细胞形态与ENaC功能活性之间的关系。4．主要的指标及测量方法（1）细胞形态学观察：扫描离子电导显微镜（SICM）（2）跨膜电阻值：跨膜电阻仪（EVOM2）（3）单通道离子电流：膜片钳cell-attached单通道记录（4）胞内钙离子:高速比率钙离子浓度测量荧光显微技术结果：1.建立了具有ENaC活性哺乳动物肾上皮细胞模型-mpkCCD细胞模型。2.醛固酮作用于mpkCCD细胞，细胞发生横向收缩纵向伸展，胞内钙离子浓度升高，整体膜和单通道水平的ENaC活性增强，表现为阿米洛利敏感的跨膜电阻升高和离子通道开放概率增加。3. LY294002能够阻断醛固酮对ENaC的激活作用，表现为细胞恢复原貌，阿米洛利敏感的跨膜电阻降低和离子通道开放概率减少。4. A23187能迅速增加胞内钙离子浓度，并增强ENaC活性，表现在阿米洛利敏感的跨膜电阻升高和离子通道开放概率增加。5. Cyt D能使细胞发生横向收缩纵向伸展的形变，ENaC活性增强，表现为阿米洛利敏感的跨膜电阻升高和离子通道开放概率增加。结论：1.醛固酮能够快速增强ENaC活性。2.醛固酮快速增强ENaC活性作用机制可能是通过快速增加胞内钙离子浓度，激活PI3-K通路，使细胞发生横向收缩纵向伸展的形变，从而增加的离子通道的开放概率。3. Cyt D能使细胞发生形变（横向收缩纵向伸展），ENaC活性增强，说明细胞骨架F-actin解聚有利于提高离子通道开放概率。