[背景与目的]依诺肝素钠是以猪肠黏膜肝素为起始物料经碱性β-消除方法制备的新一代肝素类抗凝药物,是抗凝药物中的超级重磅炸弹药物,其专利已经过期,可以合法进行仿制。基于其生物来源药品的复杂性,美国FDA提出了仿制依诺肝素钠需要与原研药开展一致性研究的要求,包括理化性质,肝素来源及降解方式,二糖组成、寡糖片段与序列,生物及生化活性以及健康志愿者体内药效学研究,也包括免疫原性的对比研究。我国仿制依诺肝素钠的一致性研究也已经启动。本课题参照FDA的研究要求,利用Top-down和Bottom-up策略进行国产仿制依诺肝素钠与原研药在理化性质、二糖组成和寡糖片段方面的一致性研究,考察不同工艺条件所产出的依诺肝素钠与原研药的一致性情况,同时考察不同上市地原研药间的差异,从而建立一致性研究方法和标准,分析仿制药与原研药的差异,为仿制药的工艺优化和质量提升提供参考,也为满足国内依诺肝素钠新的注册要求,以及国际注册奠定基础。[方法]采用Top-down和Bottom-up两种策略,对9批国产仿制依诺肝素钠与不同产地各3批原研依诺肝素钠进行结构组成的一致性研究。采用的分析方法都进行了方法验证。(1)Top-down策略是直接对比分析解析原研和仿制依诺肝素钠糖链的结构。①采用动态涂渍强阴离子交换色谱法(cetyltrimethylammonium strong anion exchange high performance liquid chromatography,CTA-SAX-HPLC)。该方法系基于电荷密度和极性差异对依诺肝素钠中的糖链进行分离和对比分析;②采用凝胶排阻色谱方法(size exclusion chromatography,SEC),基于分子量大小不同分析依诺肝素寡糖组成。(2)Bottom-up策略则是将依诺肝素钠用化学方法或酶法依诺肝素钠的糖链降解成寡糖片段,通过分析这些组成片段对比分析原研和仿制依诺肝素钠糖链的结构。本课题分别采用①肝素酶Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ联合酶解;②肝素酶Ⅰ部分酶解;③肝素酶Ⅱ部分酶解;④肝素酶Ⅲ部分酶解共四种方法对两个来源的依诺肝素钠进行降解,然后,利用SAX-HPLC方法,基于电荷密度差异对依诺肝素钠降解所得的寡糖片段进行分离和对比分析。[结果]Top-down策略研究。CTA-SAX-HPLC可将依诺肝素钠分离成25个寡糖峰。国产仿制与原研依诺肝素钠的差异主要集中在前10个低聚糖峰;不同上市地原研药寡糖峰含量仅存在微小差异;SEC-HPLC将依诺肝素钠分离成1 1个具有不同聚合度的寡糖峰,仿制与原研依诺肝素钠的差异主要集中在低聚糖单元,如三糖、四糖,而不同上市地原研药间各个寡糖含量一致。Bottom-up策略研究。肝素酶Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ联合酶解后的依诺肝素钠经SAX-HPLC分离共得到19种组分中,仿制药的△ⅣA、△Glyserox1、△ⅡS gal与原研药含量有明显差异,而不同上市地原研药存在△ⅣA、△Glyserox1、△ⅡS gal与1,6-anhydro△ⅣS 4个差异峰。依诺肝素经钠经肝素酶Ⅰ部分酶解后,经SAX-HPLC分离,得到至少12个组分,仿制与原研依诺肝素钠之间的含量存在1到2个组分的差异,不同上市地原研药存在2个差异峰。依诺肝素经钠经肝素酶Ⅱ单独酶解,经SAX-HPLC分离得到至少13个组分,仿制与原研依诺肝素钠之间的含量存在1到2个组分的差异,不同上市地原研药存在3个差异峰。依诺肝素经钠经肝素酶Ⅲ单独酶解,经SAX-HPLC分离得到至少25种组分,仿制与原研依诺肝素钠之间的含量存在1到6个组分的差异,不同上市地原研药存在6个差异峰。[结论]利用Top-down和Bottom-up分析策略综合分析仿制依诺肝素钠与原研药在理化性质、二糖组成和寡糖片段的一致性关系可知,仿制依诺肝素钠的低聚糖片段与原研药有较为明显的差异,而不同上市地原研药之间仅存在微小差异。该研究提示要进一步提升国产仿制依诺肝素钠的质量还需要从控制起始原料肝素钠质量、优化依诺肝素钠生产工艺和多批次采购原研药扩大一致性标准等三方面开展研究。