课题1.YAP对乳腺癌细胞黏附斑形成及侵袭迁移能力的影响及机制研究第一部分在临床标本中验证YAP可以影响乳腺癌的侵袭转移及预后目的:明确在临床标本中,YAP的表达水平与乳腺癌的侵袭转移是否存在相关性。方法:1.购买美国Biomax公司的乳腺癌组织芯片,该芯片包含104对乳腺癌原发灶及对应淋巴结转移灶的组织标本。该芯片被用于免疫组化实验,检测YAP在乳腺癌原发灶及转移灶中的表达水平及亚细胞定位情况,运用免疫组化评分,对YAP表达量进行量化处理及统计分析。2.运用GEO数据库,获取乳腺癌原发灶肿瘤细胞及淋巴转移灶肿瘤细胞的基因表达谱芯片,通过GSEA进行富集分析,明确淋巴转移相关信号通路。3.运用TCGA数据库及Surv Express软件,分析YAP及其下游基因表达情况与乳腺癌患者预后关系。结果:1.通过对组织芯片的免疫组化实验结果进行统计分析,我们发现,YAP在转移灶中的表达水平显著高于原发灶,此外,转移灶中YAP的胞浆及胞核评分均高于原发灶。2.GEO数据库中的基因表达谱芯片的GSEA分析结果提示,YAP相关信号标志(YAP Conserved Signature)可富集于转移灶肿瘤细胞。3.TCGA侵袭性乳腺癌数据库提示,YAP及其下游基因高表达与患者预后不良密切相关。结论:YAP的高表达及相关信号激活可以作为乳腺癌患者淋巴转移及预后不良的重要标志,YAP的过表达及异常激活提示肿瘤具有较高的转移倾向,预后较差。第二部分YAP对乳腺癌细胞系侵袭迁移能力及黏附斑形成能力的影响目的:通过体外实验检测YAP对乳腺癌细胞系侵袭、迁移及黏附斑形成能力的影响。方法:1.利用Western blot法检测乳腺癌细胞系内源性YAP表达情况,并筛选出YAP相对高/低表达细胞系进行下一步实验;2.利用YAP高表达质粒及siRNAs,在乳腺癌细胞系中过表达或敲减YAP,并利用Western blot验证其有效性;3.通过Transwell迁移及侵袭实验,检测YAP表达情况对乳腺癌细胞系侵袭迁移能力的影响;4.通过细胞黏附实验,检测YAP表达情况对乳腺癌细胞系黏附能力的影响;5.通过免疫荧光技术,利用黏附斑富集桩蛋白(Paxillin)的特性,检测YAP表达情况对细胞黏附斑形成能力的影响。结果:1.通过对乳腺癌细胞系进行Western blot的检测,我们发现高侵袭性乳腺癌(MDA-MB-231、MDA-MB-468)呈YAP高表达状态,而侵袭能力较弱的细胞系,如MCF7,T47D,YAP表达量相对较低。因此MDA-MB-231及MCF7被用于之后实验。2.在MCF7细胞系中证明YAP高表达质粒可以明显升高YAP的蛋白水平,此外,siRNAs可以有效敲减MDA-MB-231中内源性YAP的表达。同时,通过Western blot检测,筛选出两条敲减效率较高的siRNA序列。3.在MCF7细胞系中过表达YAP可以显著提高该细胞侵袭迁移能力,相反,通过敲减YAP可以有效抑制MDA-MB-231的侵袭迁移。4.在MCF7及MDA-MB-231细胞系中证实,YAP的表达量与细胞黏附能力呈正相关。5.免疫荧光实验发现,在MCF7细胞系中过表达YAP可以显著提高黏附斑的数量,而在MDA-MB-231细胞系中敲减YAP,则会显著抑制黏附斑的形成。结论:YAP可以促进乳腺癌细胞系侵袭、迁移及黏附能力以及黏附斑的形成。第三部分YAP调控乳腺癌细胞黏附斑形成能力的分子机制研究目的:明确YAP调控乳腺癌细胞黏附斑形成的具体分子机制。方法:1.向MCF7细胞系转染不同的YAP突变型质粒(S127A,S94A),并通过Western blot法和RT-q PCR法检测传染效率及YAP下游基因表达情况;2.通过Transwell迁移实验和细胞黏附实验,明确YAP的不同突变体对MCF7细胞迁移及黏附能力的影响;3.通过免疫荧光法,检测YAP突变体对MCF7细胞黏附斑形成能力的影响;4.利用Western blot法,在MCF7细胞系中检测过表达YAP突变体对黏附斑激酶(FAK)的总量及397位酪氨酸磷酸化水平的影响,同时,在MDA-MB-231细胞系中敲减内源性YAP,检测FAK总量及397位酪氨酸磷酸化水平的变化;5.在MDA-MB-231以及过表达激活型YAP(YAP-S127A)的MCF7细胞系中使用YAP-TEADs特异性抑制剂Verteporfin,通过Transwell实验、细胞黏附实验、免疫荧光实验检测细胞迁移,黏附及黏附斑形成能力的变化,同时,通过Western blot实验,明确Verteporfin对FAK总量及397位酪氨酸磷酸化水平的影响;6.在MDA-MB-231以及过表达YAP-S127A的MCF7细胞系中使用FAK特异性抑制剂Defactinib,通过Transwell实验和免疫荧光实验检测细胞迁移及黏附斑形成能力的变化。结果:YAP核内聚集型突变体(S127A)可以显著促进MCF7细胞的侵袭迁移、黏附以及黏附斑形成,而过表达TEA结合域突变型(S94A)YAP蛋白则无此效应。类似地,通过Verteporfin抑制YAP-TEADs结合可以显著减小细胞迁移、黏附能力以及黏附斑数量。以上结果说明YAP是通过入核以及与TEAD转录因子相互作用来影响细胞迁移以及黏附斑形成。Western blot显示,过表达YAP-S127A可以提高FAK第397位酪氨酸磷酸化水平,而YAP-S94A则无此效应。同样,敲减YAP或使用Verteporfin抑制YAP-TEADs结合可以显著减少FAK第397位酪氨酸磷酸化水平。因此,我们推测YAP-TEADs可能通过调控FAK磷酸化,从而影响黏附斑形成。为了进一步验证这一猜想,我们使用Defactinib特异性抑制FAK第397位酪氨酸磷酸化。实验结果显示:Defactinib可以有效逆转YAP介导的细胞迁移及黏附斑形成。结论:YAP通过入核与TEADs相互作用,调控FAK第397位酪氨酸磷酸化,进而影响细胞黏附斑的形成。第四部分YAP调控乳腺癌细胞FAK磷酸化的分子机制研究目的:明确YAP调控乳腺癌细胞FAK磷酸化的具体分子机制。方法:1.检索ENCODE数据库,下载MCF7细胞系中,TEAD的染色体免疫共沉淀测序文件(Ch IP-sequence)。2.使用Ch IP-seek软件分析TEAD的Ch IP-sequence数据,寻找可能被TEAD结合于启动子的基因集。3.利用基因表达谱芯片,确定该基因集在MCF7-NC及MCF7-YAP-S127A细胞系中的表达差异情况,明确该基因集中哪些基因可能被YAP-S127A上调。4.利用DAVID软件进行基因本体(Gene Ontology)富集,筛选出可能参与“细胞黏附”的基因。5.利用String软件,在上述步骤中获取的基因中,确定FAK的可能上游。6.RT-q PCR实验进一步验证YAP是否参与该基因m RNA水平的调节。7.Western blot实验验证YAP是否参与该基因蛋白水平的调节。8.双荧光素酶报告基因实验验证YAP对该基因启动子转录活性的影响。9.染色体免疫共沉淀实验验证YAP可以结合于该基因启动子。10.生物信息学方法分析TCGA数据库,确定YAP与该基因在临床样本中的表达是否存在相关性。11.利用Western blot,Transwell,细胞黏附实验,免疫荧光实验进一步确定该基因参与YAP介导的FAK磷酸化、细胞侵袭黏附以及黏附斑的形成。结果:通过Ch IP-Seek软件对TEAD4的Ch IP测序数据进行分析,我们找到192个可以被TEAD4结合于启动子的基因。表达谱芯片显示其中30个基因可以被YAP-S127A显著上调。通过Gene Ontology富集分析,我们发现其中CTGF、CYR61、BCAM、L1CAM、HABP2被富集与“细胞黏附”基因集。对以上6个基因进行String蛋白相互作用分析,我们发现THBS1属于FAK的直接上游。RT-q PCR以及Western blot实验显示YAP可以在m RNA以及蛋白水平上调THBS1。双荧光素酶报告基因实验验证YAP可以明显增强该基因启动子转录活性。染色体免疫共沉淀实验验证YAP可以结合于该基因启动子。TCGA数据库分析显示,在乳腺癌临床标本中,YAP与THBS1表达水平呈正相关关系。Transwell,细胞黏附实验,免疫荧光实验进一步确定THBS1参与YAP介导的FAK磷酸化、细胞侵袭黏附以及黏附斑的形成。结论:YAP通过转录激活THBS1,调控FAK磷酸化,进而调控乳腺癌细胞侵袭黏附及黏附斑形成。课题2.腹腔镜辅助胃癌根治术(D2+CME)对进展期胃癌治疗效果的研究第一部分腹腔镜D2根治联合胃完整系膜切除术(D2+CME)和腹腔镜D2根治术治疗进展期胃癌的前瞻性随机对照研究目的:比较腹腔镜D2+CME与传统腹腔镜D2根治术对进展期远端胃癌的安全性、可行性及肿瘤学预后的影响。为后续临床应用提供科学的循证依据。方法:采用前瞻性、随机、平行对照的方法,以可切除的局部进展期胃癌患者为研究对象,开展单中心临床随机对照研究。纳入标准:一、年龄:18～75岁;二、BMI<30;三、术前经胃镜和活检证实的胃腺癌患者且AJCC/UICC分期c T2-4a,N0-3,M0;四、术前临床分期评估为进展期可根治切除远端胃癌;五、无严重基础疾病;六、术前麻醉评估评分为ASA I,II或III且病人的WHO体力状态评分(Zubrod-ECOG-WHO ZPS5分法评分系统)小于两分;七、患者或其委托代理人签署知情同意书。排除标准:一、孕期或哺乳期妇女;二、严重精神障碍;三、术前接受过新辅助化疗或放疗;四、有上腹手术史;五、合并其他恶性肿瘤病史(如其他部位肿瘤,间质瘤,淋巴瘤);六、无法进行根治性切除或者因病情需要,需进行全胃切除。主要观察指标为三年无病生存率。次要观察指标为总体生存率,肿瘤复发情况,并发症率,术后恢复情况及其他指标。目前本研究已入组结束,随访还在进行中。因此本文将评估手术的短期效果。本研究已在Clinical Trials.gov注册,注册编码为NCT01978444。结果:在2014年9月至2018年6月,一共有338名患者被纳入本项研究并被随机分配至D2+CME组及D2组(其中D2+CME组169人,D2组169人)。基线分析指出在年龄、性别、ASA评分及既往病史方面,两组患者并无显著差异。手术相关资料评估显示D2+CME手术在控制术中出血(D2+CME:中位数15.0[四分位间距23.0]vs.D2:中位数37.0[四分位间距33.5]ml,p<0.0001)及淋巴结收获数(D2+CME:中位数34[四分位间距16]vs.D2:中位数27[四分位间距13],p<0.0001)方面体现出一定优势。在术后恢复阶段,D2组及D2+CME组的并发症率分别为16.0%(27/169)和20.1%(34/169)(p=0.322)。D2组中两例患者出现严重并发症。两组患者围术期死亡率均为0%。Logistic回归分析发现年龄及总手术时间为术后并发症的独立危险因素。在术后恢复期中,D2+CME组患者术后胃肠通气时间早于D2组(p=0.009)。结论:腹腔镜D2+CME手术在控制术中出血、提高淋巴结收获数及术后胃肠功能恢复方面表现出一定优势。此外,两组患者在术后并发症率及死亡率方面无明显区别。因此D2+CME手术在治疗进展期胃癌过程中是安全而有效的。对于D2+CME手术的远期肿瘤治疗效果还有待于进一步的随访跟踪评估。第二部分腹腔镜辅助远端胃切除术(D2+CME)联合胃后系膜切除在胃中部癌手术治疗中的意义与效果评估目的:通过回顾性研究的方法,评价腹腔镜辅助远端胃切除术(D2+CME)联合胃后系膜切除在胃中部癌手术治疗中的意义与效果。方法:回顾性收集我院胃肠外科2015年1月至2016年12月接受过腹腔镜辅助根治性胃切除术的胃中部癌(middle gastric cancer,MGC)患者(病理分期:p Ib-p IIIc)。通过手术记录、术中录像及术后标本照片分析患者接受的手术方式及胃后系膜切除情况,结合患者临床资料及随访情况,系统分析评价腹腔镜辅助远端胃切除术(D2+CME)联合胃后系膜切除在胃中部癌手术治疗中的意义与效果。结果:在2015年1月至2016年12月之间,我们一共收集了76例进行过腹腔镜辅助根治性胃切除术的胃中部癌患者。其中36例病人接受了腹腔镜辅助远端胃切除术(D2+CME)联合胃后系膜切除,其余40例患者接受传统的腹腔镜辅助全胃切除术(D2)。基线分析指出,两组患者的一般情况无显著性区别。D2+CME组在减少术中出血(中位数:D2+CME组14.50 ml vs.D2组38.00 ml,p<0.01),提高淋巴结获取数(中位数:D2+CME组38 vs.D2组19 ml,p<0.01)方面存在一定优势。此外,两组在术后并发症率上没有明显区别(D2+CME:11.1%vs.D2:7.5%,p=0884)。术前恢复期中,D2+CME的胃肠功能恢复时间明显短于D2(p<0.01)。通过对D2+CME组术后标本的检查,我们发现75%(27/36)的患者的胃后系膜中存在淋巴结,而胃后系膜淋巴结(Posterior mesogastric lymph node,PGLN)数目的中位数为2枚(范围:0-13)。其中,3名患者的PGLN发现存在转移。所有患者术后均进行了随访观察,D2+CME与D2组的平均随访时间分别为24月及25月。Kaplan-Meier生存分析指出两组总体生存率没有显著区别。D2+CME组及D2组的三年累积生存率分别为81.5%及63.5%(p=0.078)。单因素分析指出TN分期及手术方式为患者预后的危险因素(p<0.05)。多因素分析指出N分期为患者的独立危险因素(p<0.05)。结论:相对于传统的全胃切除,腹腔镜辅助远端胃切除术(D2+CME)联合胃后系膜切除在胃中部癌的治疗中安全而有效,同时可以达到相同的治疗效果。