产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens, C.perfringens)为革兰氏阳性杆菌,普遍存在于人类和动物的胃肠道或土壤,能广泛地导致人类和动物发病,如气性坏疽、食物中毒、坏死性小肠结肠炎和坏死性肠炎。C.perfringens根据分泌毒素类型可分为A、B、C、D和E型,其中A型导致的气性坏疽是一种发展迅猛、破坏性极大的感染,当感染超过一定浓度的C.perfringens即可迅速蔓延至全身,甚至危害生命。二战期间,由于战伤及感染C.perfringens,使气性坏疽犹如瘟疫般蔓延和发展。在现代,气性坏疽常发生在地震灾害及车祸患者的伤口深部感染中。在临床医学上,由于C.perfringens感染后发病的迅猛和不可控性,常常需要截肢以保存生命,严重的损害了患者的心理与劳动能力。由于气性坏疽的发病呈骤急性,一个早期、快速检测深部产气荚膜梭菌感染的方法学的建立是十分必要的。目前,医学上常用于检测产气荚膜梭菌的方法有培养法、生化鉴定法、酶联免疫法、质粒体分析法,这些技术被用于检测和鉴定的前提均以培养和分离细菌为前提,大大的增加获得阳性结果的时间,延误了最佳的治疗时机。鉴于目前存在的问题,本课题拟在其它研究的基础上,建立小鼠气性坏疽的动物模型,了解气性坏疽的感染发病规律,旨在对C.perfringens实时荧光PCR法在实践中的检测价值进行研究和探讨。第一部分：C.perfringens实时荧光PCR法的建立由于16SrDNA在种间的高度保守性,使之成为细菌检测的可靠标志物。建立C.perfringens实时荧光PCR法,首先选择C.perfringens16SrDNA序列的保守区设计引物,扩增目的片段长度约为105bp。回收目的片段后直接测序,经Blast比对与C.perfringens16SrRNA基因[AB566417]一致。针对目的片段设计特异的寡核苷酸探针,优化后的体系采用14个梯度浓度的C.perfringens菌液对本试验的敏感度和稳定性进行验证。结果成功的检测出1014cfu/mL～101cfu/mL的C.perfringens菌液,检测下限为101cfu/mL,平行检测整体CV均数为0.014±0.014,CV95%可信区间为(0.006-0.022)第二部分：ATCC13124毒力试验A型C.perfringens为导致气性坏疽的主要生物型。其中ATCC13124为首先从人类气性坏疽病人中分离出来的实验室标准株,在患者中能产生大量坏疽毒素。在小鼠气性坏疽动物模型建立之前,首先对ATCC13124菌株的毒力进行验证。毒力试验分为外毒素毒力试验与细菌毒力试验。C.perfringens外毒素毒力试验中,体外培养使ATCC13124在PY培养基中产生大量的外毒素,通过离心将细菌沉淀,粗制得细菌外毒素溶液。外毒素以小鼠体重为单位经尾静脉注射小鼠,通过小鼠的死亡率与外毒素剂量的关系,采用Bliss法计算出ATCC13124的外毒素对昆明小鼠的半数致死量为13.3mL/kg,95%可信区间为(11.4～15.7)mL/kg。C.perfringens细菌毒力试验中,配制一系列浓度梯度的ATCC13124菌液(5.7×109cfu/mL、5.7×108cfu/mL、5.7×107cfu/mL、5.7×106cfu/mL和5.7×105cfu/mL)取1mL分别注射到小鼠腹腔,观察小鼠死亡率、生存时间分布及细菌感染情况。结果5.7×109cfu/mL组、5.7×108cfu/mL组、5.7×107cfu/mL组、5.7×106cfu/mL组、5.7×105cfu/mL组和对照组的死亡率依次为：100%、90%、10%、0%、0%和0%,整体死亡率有显著性差异(χ2=51.900,P<0.001)组间死亡率进行两两比较：腹腔注射细菌浓度为5.7×109cfu/mL组(χ2=20.000,P<0.001,校正P<0.001)、5.7×108cfn/mL组(χ2=16.364,P<0.001,校正P<0.001)导致小鼠的死亡率与对照组有显著性差异。腹腔注射细菌浓度为5.7×107cfu/mL组与对照组的死亡率无显著性差异(χ2=1.053,P=0.305,校正P=1.000)腹腔注射细菌浓度为5.7×109cfu/mL组和5.7×108cfu/mL组导致小鼠的死亡率无显著性差异(χ2=1.053,P=0.305,校正P=1.000)。腹腔注射细菌浓度为5.7×109cfu/mL组与5.7×107cfu/mL组(χ2=16.364,P<0.001,校正P<0.001)、5.7×106cfu/mL组(X2=20.000,P<0.001,校正P<0.001)、5.7×105cfu/mL组(χ2=20.000,P<0.001,校正P<0.001)导致小鼠的死亡率有显著性差异。腹腔注射细菌浓度为5.7×108cfu/mL组与5.7×107cfu/mL组(χ2=12.800,P<0.001,校正P<0.001)、5.7×106cfu/mL组(χ2=16.364,P<0.001,校正P<0.001)、5.7×105cfu/mL组(χ2=20.000,P<0.001,校正P<0.001)导致小鼠的死亡率有显著性差异。腹腔注射细菌浓度为5.7×107cfu/mL组与5.7×106cfu/mL组(χ2=1.053,P=0.305,校正P=1.000)5.7×105cfu/mL组(χ2=1.053,P=0.305,校正P=1.000)导致小鼠的死亡率无显著性差异。5.7×109cfu/mL组小鼠存活时间中位数为1.000h,95%可信区间为(1.000～2.167)h;5.7×108cfu/mL组小鼠死亡时间中位数为2.333h,95%可信区间为(1.688-2.797)h。采用Log rank法对细菌毒力试验小鼠生存时间分布的整体比较,三种菌液浓度导致小鼠的生存时间分布有显著性差异(χ2=32.963,P<0.001)。水平间的两两比较,5.7×109cfu/mL组与5.7×108cfu/mL组(χ2=9.886,P=0.002)、5.7×109cfu/mL组与5.7×107cfu/mL组(χ2=22.550,P<0.001)5.7×108cfu/mL组与5.7×107cfu/mL组(χ2=14.875,P<0.001),不同浓度组两两比较小鼠的生存时间分布有显著性差异。5.7×109cfu/mL组与5.7×108cfu/mL组死亡小鼠表现为皮肤呈现由苍白变为青铜逐渐变成紫红色或黑色,全身性的毒血症；腹部膨胀充气,解剖后可闻到硫化氢的气味,肠道充气膨胀呈透明状。5.7×107cfu/mL组死亡的小鼠均表现为皮肤稍变紫色,肠道感染,肠道稍微膨胀充气：未死亡小鼠肠道正常,不发病。5.7×106cfu/mL组、5.7×105cfu/mL组和对照组肠道正常。第三部分：小鼠气性坏疽动物模型的建立与实时荧光PCR法的应用本部分采用A型C.perfringens典型代表的标准株ATCC13124,选用具有统计学价值的SPF级昆明小鼠作为试验动物建立气性坏疽动物模型,旨在为C.perfringens实时荧光PCR法的应用提供可统计分析的动物模型,探究其实践的应用价值。本部分采用肌注法建立无创伤情况下单一感染的小鼠气性坏疽动物模型。配制一系列浓度梯度的ATCC13124菌液(3.5×109cfu/mL、3.5×108cfu/mL、3.5×107cfu/mL)于小鼠右后肢膝关节上1/3处肌肉注射0.1mL菌液,对照组肌肉注射0.1mL的生理盐水,观察细菌感染进展。3.5×109cfu/mL组、3.5×108cfu/mL组、3.5×107cfu/mL组和对照组的死亡率依次为：100%、70%、10%和0%,整体死亡率有显著性差异(χ2=27.879,P<0.001)。肌肉注射细菌浓度为3.5×109cfu/mL组(χ2=20.000,P<0.001,校正P<0.001)、3.5×108cfu/mL组(χ2=10.769,P=0.001,校正P=0.006)的死亡率与对照组有显著性差异。肌肉注射细菌浓度为3.5×107cfu/mL组死亡率与对照组无显著性差异(χ2=1.053,P=0.305,校正P=1.000)肌肉注射细菌浓度为3.5×109cfu/mL与3.5×108cfu/mL的死亡率无显著性差异(χ2=3.529,P=0.060,校正P=0.360)。肌肉注射细菌浓度为3.5×109cfu/mL与3.5×107cfu/mL组的小鼠死亡率有显著性差异(χ2=16.364,P<0.001,校正P<0.001)。肌肉注射细菌浓度为3.5×108cfu/mL与3.5×107cfu/mL的小鼠死亡率有显著性差异(χ2=7.5,P=0.006,校正P=0.036)3.5×109cfu/mL组小鼠的存活时间中位数为15.000h,存活时间95%可信区间为(11.901～18.099)h;3.5×108cfu/mL组小鼠的存活时间中位数为21.000h,存活时间95%可信区间为(14.802-27.198)h。采用Log rank法对3组坏疽模型小鼠生存时间分布整体比较,整体的生存时间分布有显著性差异(χ2=20.922,P<0.001)。水平间两两比较,3.5×10’cfu/mL组与3.5×108cfu/mL组间(χ2=4.062,P=0.044)3.5×109cfu/mL组与3.5×107cfu/mL组间(χ2=20.284,P<0.001)、3.5×108cfu/mL组与3.5×107cfu/mL组间(χ2=8.006,P<0.005)均有显著性差异,接种不同浓度的坏疽模型小鼠的生存时间分布两两比较有显著性差异。肌肉注射不同浓度的ATCC13124菌液症状如下：3.5×109cfu/mL组在注射的12小时内均表现为红肿,僵直不能运动,红肿从下肢逐渐蔓延至上肢及股部,后肢表现为皮肤紫红有淤血聚集,全身性毒血症,后肢按压有气泡碾碎声,剖开皮肤可闻到硫化氢气味,全部小鼠出现血尿。3.5×108cfu/mL组死亡小鼠后肢感染情况与3.5×109cfu/mL组相似,但症状较轻,表现为红肿,僵直不能运动,随后红肿从下肢逐渐蔓延至上肢及股部,后肢表现为皮肤紫红有淤血聚集,但无全身性毒血症,不出现血尿,感染部位按压无气泡碾碎声。3.5×108cfu/mL组未死亡的小鼠表现为后肢红肿,48h后康复无任何症状。3.5×107cfu/mL组只有1只小鼠死亡,症状表现与3.5×108cfu/mL组死亡小鼠一致。3.5×107cfu/mL组存活的小鼠表现为后肢红肿,36h后康复无任何症状；对照组后肢表现正常无任何症状。采用了传统的细菌学方法革兰氏染色镜检、细菌厌氧培养和厌氧菌鉴定系统对动物模型进行验证。3.5×109cfu/mL组、3.5×108组与3.5×107cfu/mL组死亡的小鼠均能观察到革兰氏阳性,两端钝圆的粗大杆菌,并可看到芽孢位于细菌的一端正在形成。3.5×107cfu/mL组存活小鼠与对照组无任何革兰氏阳性菌。分泌物细菌厌氧培养,3.5×109cfu/mL组、3.5×108cfu/mL组与3.5×107cfu/mL组死亡的小鼠能培养出菌落,菌落特征为边缘粗糙透明凸起的菌落,菌落外周可见有清晰的溶血环。3.5×107cfu/mL组存活小鼠与对照组无任何细菌。小鼠气性坏疽分泌物进行培养后,使用API20A厌氧菌鉴定系统鉴定,结果鉴定为C.perfringens。采用C.perfringens实时荧光PCR法对气性坏疽动物模型分泌物进行检测,试验组均为阳性,对照组均为阴性。3.5×109cfu/mL组、3.5×108cfu/mL组、3.5×107cfu/mL组Ct值分别为21.208±2.693、28.454±2.739和32.489±2.874,整体间有显著差异(F=42.592,P<0.001)。组间多重比较显示：3.5×109cfu/mL组与3.5×108cfu/mL组间(P<0.001)、3.5×109cfu/mL组与3.5×107cfu/mL组间(P<0.001),3.5×108cfu/mL组与3.5×107cfu/mL组间(P=0.003)各浓度组间Ct值有显著性差异。结论根据16SrRNA编码基因的保守区设计引物和探针建立的C.perfringens实时荧光PCR法检测的灵敏度为1014cfu/mL～101cfu/mL,检测下限为101cfu/mL。细菌浓度在1014fu/mL～101cfu/mL范围内反应体系具有较高的稳定性。对ATCC13124的外毒素进行了初步的研究。PY培养基体外培养能使休眠的ATCC13124毒力恢复产生外毒素。小鼠腹腔注射109cfu/mL组与108cfu/mL组均能在1-3小时内发病且迅速死亡。小鼠腹腔注射ATCC13124浓度大于等于108cfu/mL能导致严重的肠道坏疽；细菌浓度达到109cfu/mL能导致小鼠100%死亡率；小鼠腹腔注射ATCC13124浓度小于等于107cfu/mL几乎不发病。小鼠肌肉注射0.1mL浓度为108cfu/mL和109cfu/mL能成功建立气性坏疽动物模型。其中108cfu/mL能在27小时内导致70%的小鼠发生气性坏疽且死亡。109cfu/mL能在18小时内导致100%的小鼠发生严重的气性坏疽且死亡。107cfu/mL不导致小鼠气性坏疽。C.perfringens实时荧光PCR法的灵敏度较革兰氏染色镜检、细菌厌氧培养法灵敏度高。通过Ct值可推断气性坏疽感染的菌落浓度指导临床实践。C.perfringens实时荧光PCR法检测结果为阳性,但Ct值较高时,提示C.perfringens感染浓度较低或者细菌已死亡,小鼠可通过自身免疫力消除而并不导致气性坏疽。因此在临床诊断过程中,C.perfringens实时荧光PCR法检测出阳性但Ct值较高时,需结合临床症状作出诊断。