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创伤后应激障碍(Posttraumatic stress disorder,PTSD),是与应激密切相关的一种精神性疾病,是由创伤性刺激、个体遗传性特征和环境之间相互作用的综合结果。目前关于PTSD发生的生物学机制尚不清晰,迄今已获得的研究成果尚不足以为临床治疗PTSD提供充分的病理生理基础。糖皮质激素受体(Glucocorticoid receptor,GR)家族成员NR3C1(Nuclear Receptor Subfamily3,Group C,Member1)和FK506结合蛋白51(FK506binding protein51,FKBP51)两种因子近来受到PTSD研究者的关注,据报道2者在PTSD的HPA轴功能紊乱过程中发挥了关键作用。GR的激活对于个体应对压力至关重要,GR与皮质醇结合后,将会转移进细胞核内,扮演转录因子或者抑制因子的角色。FKBP51可以防止GR-皮质醇复合体转位进入细胞核内,从而在转录水平调控GR的活化。多巴胺(Dopamine,DA)是一类与记忆关系非常密切的神经递质,研究发现PTSD的患者的尿液以及血浆中的DA水平升高,并且与患有PTSD的严重程度正相关。PTSD下的条件性恐惧记忆形成与杏仁核多巴胺D1受体激活有关,而应激的重要基础是HPA轴的过度激活和糖皮质激素及其受体和多巴胺递质系统功能异常,这是药物治疗纠正PTSD内环境紊乱的关键。此外,许多研究表明,脑源性神经营养因子(BDNF)在调节中枢神经系统(central nervus system,CNS)功能及PTSD和重性抑郁障碍等神经性疾病的应急效应中发挥重要作用。 目的: 本研究拟通过拮抗多巴胺受体和FKBP51表达沉默的体内外实验,探讨多巴胺D1受体对NR3C1、FKBP51表达的调控作用,以及这种调控作用是否与PTSD大鼠行为的病理生理学表现相关;并通过对PTSD大鼠BDNF与NR3C1、FKBP51表达的相关性分析,研究BDNF在PTSD发病机制中可能涉及的某些相关因素。 方法: 1、利用单程长时程应激(Single prolonged stress,SPS)方法建立PTSD大鼠模型,并给予多巴胺D1受体拮抗剂(SCH23390盐酸盐)干预2周,分别在干预大鼠模型7天和14天进行旷场实验(Open field test,OFT)、高架十字迷宫实验(Elevated plus maze,EPM)和Morris水迷宫实验(Morris water maze,MWM)等行为学评估实验,研究大鼠焦虑、学习和记忆相关行为学改变,观察SCH23390的作用。 2、利用免疫组织化学染色、免疫印迹法(western blotting)和实时定量聚合酶连反应(Real-time PCR)检测各组大鼠的海马以及杏仁核神经元NR3C1和FKBP51蛋白及其mRNA的表达,进行定性和定量分析。 3、利用siRNA沉默技术沉默原代培养的海马神经元FKBP51基因,采用Real-time PCR检测NR3C1基因的表达情况,分析SCH23390对NR3C1表达影响的可能机制。 4、体外实验,BDNF处理原代培养的海马神经元,观察其对NR3C1和FKBP51表达的影响。 结果: 1、与SPS模型组大鼠相比,SCH23390干预SPS模型7天和14天大鼠在旷场实验场箱中心区活动时间和运动距离明显增加(P<0.001),EPM开放臂活动时间、运动距离和进入开放臂次数均显著增加(P<0.001),在Morris水迷宫平台所在靶象限活动时间明显增加,同时大鼠的逃离潜伏期显著缩短(P<0.05)。 2、免疫组织化学染色结果显示:与正常对照组相比,SPS模型组大鼠海马区齿状回的颗粒细胞层和杏仁核脑区的NR3C1阳性的神经元数量明显增多,且阳性染色程度明显加深;SPS+SCH23390组大鼠海马区齿状回的颗粒细胞层NR3C1阳性细胞数目与SPS模型组相比显著减少,并且其阳性染色的程度与正常对照组近似。 3、western blotting及real-time PCR的检测结果显示:与正常对照组进行比较,SPS模型组大鼠的海马区及杏仁核区NR3C1蛋白及其mRNA的表达均显著增加,而FKBP51蛋白及其mRNA的表达出现明显下降;SCH23390干预SPS模型7天及14天,NR3C1的蛋白及其mRNA表达明显下调,同时FKBP51的蛋白及其mRNA表达的明显上调。 4、siRNA沉默海马神经元FKBP51,再用10μM SCH23390盐酸盐处理FKBP51沉默的海马神经元24h后则不能下调NR3C1mRNA表达(P>0.05);而与SCH23390孵育组组相比,10μM SCH23390孵育control siRNA组神经元,其NR3C1mRNA的表达水平并没有显著性的差异(P>0.05)。 5、与正常对照组相比,在海马神经元,NR3C1及其mRNA在SPS7和SPS14组均增加;而FKBP51及其mRNA在SPS7和SPS14组均减少;BDNF在SPS14组减少(P<0.05),而在SPS7组没有显著变化。与正常对照组相比,在mPFC,NR3C1在SPS7组显著减少(P<0.05),而在SPS14组无显著差异;NR3C1mRNA在SPS14组增加,而在SPS7组无显著差异;BDNF具有与NR3C1类似的表达;FKBP51蛋白和mRNA各组之间没有显著差异(P>0.05)。与正常对照组相比,在下丘脑,NR3C1在SPS7组显著减少(P<0.05),而在SPS14组无显著差异;NR3C1mRNA在SPS7和SPS14均没有显著变化;BDNF具有与NR3C1类似的表达;FKBP51各组之间没有显著差异(P>0.05);而FKBP51mRNA在SPS7减少,而在SPS14组无显著差异。在海马神经元、mPFC和下丘脑,BDNF mRNA在SPS7和SPS14均没有显著变化(P>0.05)。 6、体外培养海马神经元,BDNF处理12h,可以显著降低FKBP1和NR3C1的蛋白水平。 结论: 1.多巴胺D1受体通过抑制FKBP51的表达,介导上调NR3C1基因的表达,参与PTSD行为表现的分子机制。 2.SPS刺激下,NR3C1和FKBP51和BDNF在不同脑区,有不同的变化趋势。BDNF可以降低海马神经元NR3C1和FKBP51的表达。