海洋病原菌O1血清型鳗弧菌鳗弧菌素合成酶基因angE和angD的克隆、表达及功能鉴定

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本文对海洋病原菌O1血清型鳗弧菌的两个鳗弧菌素合成酶基因angE和angD进行了克隆、表达和相关的功能鉴定。   在鳗弧菌素合成酶基因angE的研究工作中,首先通过对鳗弧菌pEIB1质粒的全序列数据进行分析,通过HPLC检测并证明了AngE蛋白具有2,3-DHBA-AMP连接酶活性;在转录和翻译水平上考察了angE基因的内源表达情况,RT-PCR和Western-blotting的结果证明了angE在鳗弧菌体内是一个正常转录和翻译的功能基因。   在鳗弧菌鳗弧菌素合成酶基因angD的研究工作中,首先通过对鳗弧菌pEIB1质粒的全序列数据进行分析,初步证明angD基因编码了一个鳗弧菌素合成酶:Sfp类型的磷酸泛酰基转移酶;将angD基因在大肠杆菌中进行了可溶性表达,并完成了对AngD蛋白的纯化;对鳗弧菌磷酸泛酰基转移过程中所涉及到的三种载体蛋白ArCP、PCP和AcpV进行了基因克隆,并对这三种载体蛋白进行了可溶性表达和纯化;利用纯化的AngD蛋白分别与三种纯化的载体蛋白建立了相应的离体酶活测评体系,检测并证明了AngD蛋白在离体条件下能够有效的催化磷酸泛酰基转移反应,且其最适底物是ArCP、PCP;将鳗弧菌的三种载体蛋白分别与AngD蛋白在大肠杆菌中进行共表达,检测并证明了AngD在体内条件下能够有效的催化磷酸泛酰基转移反应,且其最适底物是ArCP、PCP。
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