股骨头坏死是骨科较为常见的一种疾病。由于患病者大多为中青年,而且该疾病的致残率极高,对患者家庭和社会的经济负担均较大。有研究指出,在未经治疗的情况下,股骨头坏死的患者80%最终会发生股骨头塌陷,进一步继发骨关节炎,最终须行关节置换术缓解疼痛、改善功能。虽然近年来人工关节置换术有了长足的发展,但是由于患者多为中青年,绝大多数患者需接受至少1次以上的翻修术,且术后功能欠理想。因此,近年来把股骨头坏死治疗的重点集中到了早期治疗上,目的主要在于预防股骨头塌陷,防止髋关节结构改变。然而,到目前为止,尚无任何治疗方法可以确切有效的达到以上目的。低强度脉冲超声是一种具有生物声学效应的机械波。因其高效、无创的优势,被美国FDA批准用于骨不愈的治疗。大量的研究发现LIPUS可以促进骨生长,改善局部血供,促进成骨细胞活性和间充质干细胞的成骨分化。这一系列的作用机制,或许在股骨头坏死早期修复过程中可以发挥积极的促进作用。本人博士期间一直从事生物声学效应和股骨头坏死早期非手术治疗方面的研究。已有多篇SCI论文发表。本实验分为五个部分：一、成功构建与临床特点相似的兔早期股骨头坏死模型；二、探讨低强度脉冲超声防治早期股骨头坏死的作用；三、在低强度脉冲超声治疗兔股骨头坏死过程中,观察股骨头内骨形态蛋白2(BMP-2)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)及其基因的动态表达情况。四、应用不同能量强度的超声治疗股骨头坏死,探寻疗效最佳的超声能量强度。五、通过体外实验,研究微泡剂增强超声生物效应机制的作用。我们的研究表明,低强度脉冲超声或可以阻止或延缓激素诱导早期股骨头坏死疾病的进程；BMP-2和VEGF或许在该疗效的机制中有重要作用；100-200 mW/cm2强度的疗效优于高强度超声(1 W/cm2)。微泡剂或可进一步增强超声的生物效应。第一部分：兔股骨头坏死模型的诱导和鉴定目的：建立与人股骨头坏死病变过程类似,简单、可靠的激素诱导的兔股骨头坏死模型。方法：取16只兔子,随机对半分为实验组和对照组。实验组进行造模,采用单次低剂量内毒素(10μg/kg)联合三次甲基强的松龙针(20mg/kg)的方法,每次用药间隔24小时。对照组注射同样剂量的生理盐水。将动物最后一次注射激素后6周静脉注射过量戊巴比妥处死。取股骨头标本做组织病理学分析,结合影像学、骨密度和生物力学鉴定股骨头坏死模型是否成功建立。结果：6周内,实验组和对照组均无兔子死亡。组织病理学分析发现实验组股骨近端有坏死灶(7/8),可见骨髓坏死和大量空骨陷窝。对照组标本均未见坏死灶。实验组的骨小梁结构紊乱,小梁厚度明显降低,空骨陷窝率明显增高,大量骨髓坏死组织。对照组骨小梁结构正常,有序。x线检查两组均无股骨头塌陷发生。磁共振扫描可见实验组股骨近端异常信号,而对照组未见异常信号。实验组骨密度显著低于对照组。结论：使用内毒素+甲强龙的方法,能成功诱导兔早期股骨头坏死模型。且方法简单、可靠,重复性较高。第二部分：低强度脉冲超声防治激素诱导早期股骨头坏死目的：大剂量激素的使用是股骨头坏死的最主要病因,但是目前临床上仍缺少有效的措施预防和治疗该疾病。低强度脉冲超声是美国FDA批准用于治疗骨不愈合的一项有效的无创治疗方法。大量研究发现低强度超声可以促进骨生长和血管生成,因此本研究的目的在于探讨超声是否可以防治早期股骨头坏死。方法：使用内毒素+甲强龙的方法诱导24只兔子双侧股骨头坏死模型。每只兔子的左侧髋部用超声干预,定为超声治疗组。超声干预强度为200mW/cm2,20 min/day。右侧定为对照组,不予超声干预。超声治疗12周后,处死所有兔子,取出标本进行Micro-CT,生物力学,组织学,免疫组化等检查内容。结果：12周后,生物力学检测发现对照组的最大抗压力为355±38 N,超声治疗组为441±78 N(p<0.05)；Micro-CT发现超声组bone volume/total volume为49.29%±12.37%,高于对照组(p=0.022)37.93%±8.37%；超声组空骨陷窝率17%±4%,低于(p=0.002)对照组的26%±9%.超声组的矿化形成率(2.3±0.8μm/day高于(p=0.001)对照组的1.6±0.3μm/day.超声组血管数量为7.8±3.6/mm2,多于(p=0.025)对照组的5.7±2.6/mm2。结论：低强度脉冲超声可以促进骨修复和血管生成,可以防治激素诱导的早期股骨头坏死。第三部分：LIPUS对坏死股骨头内VEGF和BMP-2及其基因表达的影响目的：本文第二部分用实验证实了低强度脉冲超声可以防治激素诱导早期股骨头坏死。本研究的目的旨在进一步深化研究LIPUS的作用机制。应用低强度脉冲超声治疗早期股骨头坏死,观察股骨头内VEGF和BMP-2及其基因的动态表达情况。方法：使用内毒素+甲强龙的方法诱导32只兔子股骨头坏死模型。随机选取2只在肌注甲强龙4周后处死,取股骨近端标本行组织病理学分析,鉴定骨坏死是否成功诱导。其余30兔子的左侧髋部用超声干预,定为超声治疗组。超声干预强度为200mW/cm2,20min/day。右侧定为对照组,不予超声干预。在超声治疗1周,2周,4周,8周,12周时各随机处死6只兔子,取出股骨头标本用实时定量PCR,Western blot检测VEGF和BMP-2及其基因的表达情况。结果：激素肌注4周后,经过组织病理学分析,坏死诱导成功。经过实时PCR检测,超声组VEGF mRNA在治疗后1,2,4周时的表达均高于对照组(P均<0.05)。超声组BMP-2 mRNA在治疗后1-8周均高于对照组(P均<0.05)。超声组VEGF蛋白表达量在治疗后1-8周均高于对照组(P均<0.05)。超声组BMP-2蛋白表达量在超声治疗后1-12周均高于对照组(P均<0.05)。结论：在一定时间内,低强度脉冲超声可以提高VEGF和BMP-2及其基因的表达。第四部分：比较不同强度LIPUS防治激素诱导股骨头坏死疗效的实验研究目的：LIPUS可以促进骨组织修复,但是其疗效与参数密切相关。本文通过早期股骨头坏死模型,探讨不同强度LIPUS防治股骨头坏死疗效的差异。方法：使用内毒素+甲强龙的方法诱导24只兔子双侧股骨头坏死模型。随机等分为3组(n=8),分别为低强度(100mW/cm2)组、中强度组(200mW/cm2)和高强度组(1W/cm2,)。每只兔子的双侧髋部均使用超声干预。超声干预20 min/day。在治疗12周后,处死所有兔子,取出标本进行生物力学,组织学,免疫组化等检查。结果：12周后,生物力学检测发现高强度组最大抗压载荷低于低强度组和中强度组,且差异具有统计学意义(p<0.05)。病理组织学分析发现高强度组骨小梁面积百分比低于低强度和中强度组(p<0.05),高强度组的空骨陷窝率低于低强度组和中强度组(p<0.05),而低强度组和中强度组在两组数据之间差异无统计学意义(P>0.05)。高强度组血管数量少于低强度组和中强度组(p<0.05),低强度和中强度组的血管数量差异无统计学意义(P>0.05)。结论：低强度脉冲超声强度为100mW/cm2和200mW/cm2时防治股骨头坏死疗效优于强度为1 W/cm2的疗效。第五部分：微泡超声增强庆大霉素对大肠杆菌的抗菌作用目的 大肠杆菌是内植物感染的常见致病菌之一,低强度超声被发现可以增强抗菌药物的抗菌效能,本实验旨在观察微泡是否可以进一步增强超声与庆大霉素抑制大肠杆菌的协同效能,并探讨其可能机制。方法 配制107 CFU/ml大肠杆菌(ATCC 25922)悬液,分为空白对照组、微泡(Sonovue)组、超声组和微泡超声组,每组按照庆大霉素浓度进一步分为0、1、2μg/ml三个亚组(n=8),微泡浓度：10%(v/v),超声辐照强度：100mW/cm2,频率：46.5KHz,占空比：33%,辐照时间：12 h,平板计数法比较各组残留活菌密度,取对数(log10 CFU/ml),行统计学分析。每组另取部分菌液行透射电镜扫描,观察残留菌的微观形态。结果无庆大霉素时,4组残留菌量差异无统计学意义；庆大霉素1 μg/ml时,微泡超声组(5.44±0.49 1og10 CFU/ml)与空白对照组(7.44±0.64 log10 CFU/ml)、微泡组(6.86±0.29 log10 CFU/ml)、超声组(7.19±0.38 log10 CFU/ml)的差异均有统计学意义；庆大霉素浓度为2μg/ml时,微泡超声组(2.87±0.28 log10 CFU/ml)的菌量与空白对照组(4.45±0.43 log10 CFU/ml)、微泡组(4.33±0.40 log10 CFU/ml)、超声组(3.89±0.37 log10 CFU/ml)仍有统计学意义。上述药物浓度时微泡组与空白对照组的菌量差异均无统计学意义。庆大霉素浓度为1μg/ml和2μg/ml时,微泡超声组残留菌量均低于另外三组,且差异均有统计学意义(P均<0.05)。透射电镜提示,与单纯超声辐照相比,微泡超声辐照可进一步改变细菌胞膜的形态,胞膜皱褶更显著,存在较多不连续。结论与单纯超声辐照相比,微泡超声可以进一步提高庆大霉素对大肠杆菌的抗菌效果。微泡可以进一步增强超声的生物效应。