选题依据:七叶一枝花Paris polyphylla Smith var.chinensis是一种多年生的百合科重楼属药用植物,由于药理作用突出,以中药饮片和中药成方制剂广泛用于云南白药、季德胜蛇药、宫血宁胶囊和抗病毒颗粒等著名的常用成方制剂和临床及相关产业。七叶一枝花生长周期长,对生长所需的环境要求较高,且现今主要依赖野生资源供应,随着多年以来过度采挖,七叶一枝花资源逐渐枯竭,供求矛盾日益突出。而在多种人工繁育的方式中种子繁殖是最适于进行规模化、标准化生产七叶一枝花的方式,但种子生产中同样存在种源难以确定、种子检验标准缺失、植株抗倒伏能力差以及不同繁育环境对药材质量的影响没有系统的评价等问题。因此本研究针对七叶一枝花面临的相关问题进行系统的研究,以期能够解决实际生产中的一些难题,为七叶一枝花标准化建设提供科学依据。目的:1.结合已成熟的检验方法及规程,探索出适用于七叶一枝花种子质量检测的方法,制定出科学合理有效的检验体系,以期用于七叶一枝花种子生产、使用和流通中质量的评价,完善之前检验标准的不足。2.七叶一枝花在实际生长过程中会出现相同基原产生不同性状,不同基原存在性状相似的现象。通过基原考证、形态学分类和DNA条形码技术相结合,解决七叶一枝花种源混乱的问题。3.针对七叶一枝花生长过程中植株生长过高,易倒伏,不利于种子繁育后期的成熟和种子收获这一问题,利用不同的植物生长调节剂来改善植株茎秆的生长状况,通过提高植株抗倒伏能力,从而解决因抗倒伏能力差而引起的产量减少的问题。4.通过测定七叶一枝花在不同环境下有效成分含量的变化,系统评价不同繁育环境对七叶一枝花不同采收部位的影响,为采收、栽培等后续的研究提供理论依据。方法:1.整理不同产地收集的样品,结合七叶一枝花的植物形态特征,利用DNA条形码技术进行鉴定,主要步骤包括供试品处理、DNA提取、PCR扩增、测序、序列拼接比对、物种确定及ITS2遗传序列特征的分析。2.收集七叶一枝花种子样品,从种子扦样、净度分析、发芽实验、真实性鉴定、水分测定、生活力测定、重量测定和健康度测定等多个检测项目进行考证,研究七叶一枝花种子中各项指标测定的合理性,并着重对种子标准中的重量测定和生活力检测等方法的探索研究。其中生活力的测定实验分为4部分,分别为氯化三苯四唑(2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride,TTC)检测溶液的配制、种子生活力检测影响因素考察、阴性对照方法的实验及种子生活力检测。3.使用多效唑、缩节胺和阴性对照分别对茎秆定期喷施。按期测量植株高度变化,并观察七叶一枝花叶片颜色的变化,判断所用药剂是否对植株产生药害,其观测指标包括生长情况,开花时间及种子收获情况。4.分别在山陇田、水稻田和林下3种繁育环境下,收集6个月七叶一枝花的新根茎、老根茎、地上部分和根须等不同部位,通过测定不同时间和不同繁育环境下各采集部位重楼皂苷含量的分布情况,以此来作为栽培、采收等的研究依据。结果:1.七叶一枝花种子的鉴定结果中,不同产地收集的样品有15份检测结果与GenBank库中比对结果不完全一致,相似度未能达到100%。相同基原不同性状的样品其ITS2序列与GenBank库中登录号比对后结果一致,皆为GU302308,相似度均为100%。2.七叶一枝花种子的扦样、净度分析、发芽实验、真实性鉴定、健康度测定、重量测定和发芽经实验均可按标准操作,但并不适用于水分测定。生活力测定的最佳反应条件是:TTC溶液浓度是0.3%,温度是35℃,反应时间是2.5-3 h。3.喷施试剂对叶片颜色无明显改变,证明实验所用生长调节剂的浓度对七叶一枝花幼苗植株无明显药害,与空白组相比,喷施多效唑和缩节胺对减缓植株增长有明显作用,且多效唑作用效果比缩节胺更明显。4.七叶一枝花重楼皂苷含量从高到低分布情况:新根茎>老根茎>地上部分>根须。新根茎和老根茎含量均达到2015版《中国药典》标准,且新茎中皂苷含量均大于老根茎,各部位均以重楼皂苷Ⅶ和重楼皂苷Ⅵ为主。结论:1.ITS2序列对七叶一枝花有着稳定的鉴别能力,且不同叶形、不同叶片数和萼片数等性状都确定为七叶一枝花。同时可以看出七叶一枝花的不同性状特征中的叶片数、萼片数和叶形均不应作为其主要的形态分类依据。2.结合七叶一枝花种子的生理特性,系统考察了七叶一枝花种子各项指标的测定方法,着重对重量测定、生活力检测等进行研究,为七叶一枝花种子质量的检验方法提供了科学依据。3.初步解决了植株徒长,易倒伏的问题。从统计结果可以看到,多效唑和缩节胺虽然也有个别植株增长较快的现象,但和喷水的对照组相比,空白对照组增长速度明显高于正常施药组。多效唑和缩节胺均能减缓植株过快增长,且多效唑作用效果更明显。4.在不同繁育环境下,七叶一枝花各部位重楼皂苷含量的变化趋势略有不同,但均以根茎部位含量最高,且均以重楼皂苷Ⅶ和重楼皂苷Ⅵ为主。不同的月份会出现重楼皂苷含量显著增高的现象,这对于制定采收时间有一定的参考价值。