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前列腺素(prostaglandin,PG)对禽类的排卵功能有重要的作用,是排卵的关键调节因子,可以促进产蛋鸡产卵的开始和刺激宫缩。黄体生成素(LH)和前列腺素PGE1、PGE2能增强卵泡膜细胞层中的纤溶酶原激活物(PA)活性,膜细胞中非卵泡缢痕处PA参与卵泡生长中卵泡基质的降解与重建;缢痕处的PA活性明显增强,与成熟卵泡的最终破裂和排卵有关。同时前列腺素能够通过cAMP信号转导途径促进孕酮的合成来加强LH的作用,而LH能够诱导早期膜细胞的分化,从而影响卵泡及卵母细胞的发育。随着有腔卵泡的进一步发育,有一部分生长卵泡率先开始了快速发育。在此部分卵泡中又有一部分优先发育最终被选择确立为优势卵泡。LH在这一过程中发挥着重要作用,并且优势卵泡在选择期具有LH依赖性的倾向。PG在卵泡的选择发育上即卵泡优势化上起重要作用,但目前优势卵泡选择的机制仍不是很清楚,有可能与卵泡刺激素(FSH)的作用以及卵巢自分泌、旁分泌产生的调节因子有关。为了研究优势卵泡选择的机制,本实验以鸡等级前小黄卵泡膜细胞为模型研究PGE1对等级前小黄卵泡膜细胞增殖的作用,旨在揭示PGE1对膜细胞发育调控的作用及其机理。
膜细胞包括膜内层细胞和膜外层细胞,内层细胞可以合成孕酮并以孕酮为前体物合成睾酮,外层通过芳香化酶的作用将内层合成的睾酮转化为雌二醇。为了更好的研究PGE1对膜细胞发育的调控机理,本实验分离膜细胞的内外两层,以膜外层为模型研究PGE1对膜细胞发育的调控机理,从而避免了膜内外层之间可能存在的对PGE1作用干扰的联系,可以更清晰的了解PGE1的调控机理。然而单独的膜外层在体外无血清培养时生长状况不良好,使用血清培养时血清中的类固醇激素可能对实验结果产生干扰。本实验采用了经活性炭脱去类固醇的血清。利用去类固醇血清体外培养膜外层细胞,细胞生长良好而且避免了血清中类固醇激素对药物的可能影响,可作为评价激素、药物、毒物内分泌作用的体外培养模型。
利用产蛋鸡小黄卵泡膜细胞培养模型研究了LH对等级前发育的小黄卵泡膜细胞增殖的影响及其信号转导途径。单层培养的膜细胞用LH(0.1—100 ng/ml)、蛋白激酶A(PKA)激活剂forskolin(FRSK,0.1—10μmol/L)及抑制剂H89(0.01—1μmol/L)或蛋白激酶C(PKC)激活剂佛波酯(PMA,0.1—10 nmol/L)及抑制剂H7(0.01—1μmol/L)单独或共同处理,36h后测定膜细胞增殖的变化。结果显示,LH和FRSK均可促进小黄卵泡膜细胞的增殖,且LH的促增殖作用可被H89阻断,而PMA无显著的促进作用,且H7不能阻断LH的促增殖作用。由此推断:LH的促小黄卵泡膜细胞增殖作用主要是通过PKA途径进行的。
在此基础上,再利用膜细胞培养模型研究PGE1对等级前发育的小黄卵泡膜细胞增殖的影响及其作用机理。单层培养的膜细胞0.5%去类固醇血清预培养16h后用药物处理,36h后测定膜细胞增殖的变化。结果显示,PGE1(0.1—10 ng/ml)的作用类似LH,能够促进小黄卵泡膜细胞的增殖,且PGE1的促增殖作用可被H89阻断,而PMA无显著的促进作用,且H7不能阻断PGE1的促增殖作用;同时前列腺素受体阻断剂SC—19220(10—7—10—5M)能够抑制LH和PGE1的促增殖作用(P<0.05),前列腺素合成阻断剂indomethacin(10—7—10—5M)也可以抑制LH的促增殖作用(P<0.05)。由此推断:PGE1能够促进等级前发育的小黄卵泡膜细胞增殖,并且通过PKA途径介导LH的促小黄卵泡膜细胞增殖作用。
以上实验表明,本实验所建立的等级发育前的小黄卵泡膜细胞培养模型对LH敏感,PG可促进膜细胞的增殖,在LH和PG的促膜细胞增殖作用中,cAMP—PKA系统参与其胞内信号传递过程。此结果将有助于揭示禽类等级前卵泡发育经过卵泡选择成为等级的卵泡的激素调节机理,促进禽类繁殖力的提高。