论文部分内容阅读
目的：脑出血(Intracerebral hemorrhage, ICH)是严重及较常见的脑血管疾病，流行病学显示高死亡率、高发病率、预后率低的特点。ICH的全球发病率逐年上升[1]。尽管目前临床上的治疗方法有所提升，但在手术治疗后，脑出血患者仍有不同程度的神经功能障碍[2]。中枢神经系统损伤后，星形胶质细胞发生（Astrocyte,AST)活化，终足与神经元之间可形成广泛的“突触”样结构并释放多种神经生成因子，如血管内皮生长因子等有助于神经损伤修复；但后期 AST过度活化，胞体增大缠结形成致密的胶质瘢痕，阻碍轴突再生。本课题组前期工作证实ICH后血肿损伤区存在胶质瘢痕形成。自噬是细胞自我降解的过程，在营养不足和氧化应激的情况下，通过降解受损的细胞或细胞内的成分来维持体内稳态。已经证实自噬能抑制脊髓损伤后的胶质瘢痕形成，促进神经功能恢复[3]。然而，目前关于自噬对ICH后损伤区胶质瘢痕形成的影响，国内外相关报道资料较少[3]。因此，本实验的主要目的是评价自噬对ICH后损伤区胶质瘢痕形成的影响。
方法：本研究分为3部分。
1、立体定位向脑内苍白球注入胶原酶（2.5μL）复制脑出血模型。假手术组注入等体积生理盐水。为了解自噬体的形成，6只大鼠随机分为假手术组和脑出血组。脑出血后第7天处死大鼠。假手术组大鼠于第7天处死。取大鼠脑组织进行透射电镜观察。
2、为评价脑出血后不同时间点自噬标志物的动态变化，将50只大鼠随机分为假手术组（n=10）和脑出血组（n=40）。在脑出血后第3、7、14、28天处死大鼠。假手术组大鼠于第3天处死。免疫组织化学和免疫印迹法分别检测自噬相关蛋白P62、Beclin-1和微管相关蛋白1轻链3（Microtubule-associated protein1 light chain3，LC3）的表达情况。
3、为探讨ICH后自噬对胶质瘢痕的影响，将50只大鼠随机分为5组：假手术组、脑出血组、自噬诱导剂(雷帕霉素（Rapamycin，RAPA))ICH+RAPA组、自噬抑制剂（3甲基别嘌醇（3-Methyladenine，3-MA））ICH+3-MA组、阴性对照组ICH+vehicle组。每组10只。大鼠于脑出血后6天、死亡前2小时腹腔注射RAPA及3-MA， ICH+vehicle组注射同等量DMSO溶剂[24]。在脑出血后第7天进行神经功能评分，免疫印迹法分别检测自噬相关蛋白P62、Beclin-1和LC3的表达情况，神经胶质原纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP，AST标记物)GFAP的表达趋势，荧光免疫及激光共聚焦检测脑出血后增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen， PCNA+)/GFAP+密度的变化及GFAP的时空表达。
结果：1、电镜结果显示：假手术组胞内具有正常的细胞核，线粒体，突触，内质网，髓鞘轴突且没有自噬泡；而ICH后电镜下可见细胞内出现空泡结构；受损组织被自噬泡包裹，形成自噬体。
2、Western blot显示：脑出血后Beclin1、LC3蛋白表达较假手术组增高，于7天开始达到高峰。P62蛋白表达于ICH后3天开始逐渐降低。应用RAPA及3-MA腹腔注射后，与ICH+vehicle组比较，ICH+RAPA组Beclin1、LC3蛋白表达明显增高， P62蛋白表达降低；ICH+3-MA组Beclin1、LC3蛋白表达降低，P62表达增高。
3、RAPA及3-MA腹腔注射后免疫化学及蛋白表达：与ICH+vehicle组比较，ICH+RAPA组的GFAP阳性表达及PCNA+/GFAP+核数减少，GFAP的蛋白表达明显下调。相反，ICH+3-MA组中GFAP阳性表达和PCNA+/GFAP+细胞核的数目显著增加，以及GFAP的蛋白表达上调。
结论：
1.脑出血后损伤区周围存在自噬表达
2.自噬的激活在减轻ICH后损伤区胶质瘢痕中起重要作用，且能促进大鼠的神经功能恢复。
方法：本研究分为3部分。
1、立体定位向脑内苍白球注入胶原酶（2.5μL）复制脑出血模型。假手术组注入等体积生理盐水。为了解自噬体的形成，6只大鼠随机分为假手术组和脑出血组。脑出血后第7天处死大鼠。假手术组大鼠于第7天处死。取大鼠脑组织进行透射电镜观察。
2、为评价脑出血后不同时间点自噬标志物的动态变化，将50只大鼠随机分为假手术组（n=10）和脑出血组（n=40）。在脑出血后第3、7、14、28天处死大鼠。假手术组大鼠于第3天处死。免疫组织化学和免疫印迹法分别检测自噬相关蛋白P62、Beclin-1和微管相关蛋白1轻链3（Microtubule-associated protein1 light chain3，LC3）的表达情况。
3、为探讨ICH后自噬对胶质瘢痕的影响，将50只大鼠随机分为5组：假手术组、脑出血组、自噬诱导剂(雷帕霉素（Rapamycin，RAPA))ICH+RAPA组、自噬抑制剂（3甲基别嘌醇（3-Methyladenine，3-MA））ICH+3-MA组、阴性对照组ICH+vehicle组。每组10只。大鼠于脑出血后6天、死亡前2小时腹腔注射RAPA及3-MA， ICH+vehicle组注射同等量DMSO溶剂[24]。在脑出血后第7天进行神经功能评分，免疫印迹法分别检测自噬相关蛋白P62、Beclin-1和LC3的表达情况，神经胶质原纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP，AST标记物)GFAP的表达趋势，荧光免疫及激光共聚焦检测脑出血后增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen， PCNA+)/GFAP+密度的变化及GFAP的时空表达。
结果：1、电镜结果显示：假手术组胞内具有正常的细胞核，线粒体，突触，内质网，髓鞘轴突且没有自噬泡；而ICH后电镜下可见细胞内出现空泡结构；受损组织被自噬泡包裹，形成自噬体。
2、Western blot显示：脑出血后Beclin1、LC3蛋白表达较假手术组增高，于7天开始达到高峰。P62蛋白表达于ICH后3天开始逐渐降低。应用RAPA及3-MA腹腔注射后，与ICH+vehicle组比较，ICH+RAPA组Beclin1、LC3蛋白表达明显增高， P62蛋白表达降低；ICH+3-MA组Beclin1、LC3蛋白表达降低，P62表达增高。
3、RAPA及3-MA腹腔注射后免疫化学及蛋白表达：与ICH+vehicle组比较，ICH+RAPA组的GFAP阳性表达及PCNA+/GFAP+核数减少，GFAP的蛋白表达明显下调。相反，ICH+3-MA组中GFAP阳性表达和PCNA+/GFAP+细胞核的数目显著增加，以及GFAP的蛋白表达上调。
结论：
1.脑出血后损伤区周围存在自噬表达
2.自噬的激活在减轻ICH后损伤区胶质瘢痕中起重要作用，且能促进大鼠的神经功能恢复。