钙结合蛋白-D28K（Calbindin D-28k, CaBP-D28k）是钙结合蛋白家族重要成员,广泛分布于神经系统,能通过与钙离子、胱天蛋白酶-3、细胞膜三磷酸腺苷二脂酶和P38等结合调控其活性。在帕金森病（Parkinson’s disease, PD）患者脑黑质致密区存在少量抗变性能力很强的DA能神经元细胞,其共同特征是胞浆内都含CaBP。在遇到缺血和神经兴奋性毒性时,CaBP阳性神经元细胞能够存活,提示CaBP对神经细胞具有保护作用。细胞凋亡是包括PD在内的许多神经系统疾病中神经元细胞退行性病变的重要方式,而胞内钙离子超载是神经元细胞发生凋亡的诱因之一。作为一种钙离子快速缓冲蛋白,CaBP通过与钙离子结合对各种生物化学信号发生反应,限制细胞内游离钙离子浓度的过度升高,作为酶激活剂激活Ca2+-ATP酶调节钙离子的浓度,通过调节离子通道来促进钙离子的扩散,在神经元细胞出现长时间高强度神经活动时保护细胞免受钙超载的损害。增加DA神经细胞内CaBP量可防止其产生退行性病变,达到治疗PD的目的。对于如何增加DA神经细胞内CaBP的量,目前主要局限于体外细胞水平和以病毒为载体的体内短暂表达,而CaBP-D28k在DA神经细胞内表达的转基因动物模型未见报道,对DA神经细胞保护机制还需进一步研究。本研究用脑组织特异酪氨酸羟化酶（Tyrosine hydroxylase, TH）基因启动子构建CaBP-D28k表达载体,用二甲基亚砜（DMSO）处理精子制备转基因小鼠,建立用于PD研究的转基因动物模型。首先,根据发表的小鼠TH启动子序列设计引物,用重叠PCR扩增小鼠TH启动子,测序正确后构建重组表达质粒pTH-EGFP,用脂质体分别转染TH+MN-9D细胞和TH-ECV细胞,根据EGFP报告基因的表达与否来验证TH启动子的调控能力。在此基础上,用PCR克隆5个不同的TH启动子基因片段,用相同策略获得能驱动外源基因在脑组织中特异表达的TH启动子核心序列。然后,用RT-PCR从小鼠脑组织中扩增CaBP-D28k cDNA,将其克隆入含TH启动子的表达载体,获得的重组载体pTH-CB经脂质体包裹后转染MN-9D细胞,用RT-PCR、免疫沉淀法检测CaBP-D28k的表达,用6-羟多巴胺复制细胞凋亡模型,用细胞原位免疫印迹法检测转染细胞中抗凋亡因子bcl-2的表达,用Hoechst染色、胱天蛋白酶-3活性检及钙依赖性磷脂结合蛋白Annexin V/PI检测法,评价CaBP的抗细胞凋亡作用。进而将DMSO处理的精子与pTH-CB孵育,将体外受精获得的胚胎移植小鼠,用Western blot等试验检测PCR检测转基因阳性鼠黑质部CaBP-D28k表达,用MPTP复制PD模型,通过自主活动、游泳实验、悬挂实验等研究转基因鼠的行为学以及黑质致密部TH阳性细胞数的改变,来验证CaBP的抗MPTP对神经细胞的损伤作用。结果表明,克隆的TH启动子为3650bp,其序列与发表的TH启动子序列完全一致,能驱动EGFP报告基因在MN-9D细胞中表达。用PCR扩增的450bp、1500bp、2000bp、2400bp、3650bp TH启动子序列构建报告载体,其转染的MN-9D细胞培养中EGFP阳性细胞的比例无统计学显著性差异（分别为8.01%、7.97%、7.85%、7.72%、7.74%）,但在其转染的THECV细胞培养中,EGFP阳性细胞比例分别为6.51%、6.35%、6.71%、0.89%、1.02%,3650bp和2400bp启动子在TH-细胞中的表达调控能力受到明显抑制,初步证明TH启动子中组织特异性调控元件主要位于2400bp～2000bp区域。用RT-PCR从小鼠脑组织中扩增的785bp CaBP-D28k cDNA与已报道的序列完全一致,用TH启动子调控的CaBP-D28k表达载体转染MN-9D细胞,其CaBP-D28k mRNA及蛋白表达量显著高于对照组,表达的CaBP能显著促进细胞内bcl-2表达,能抑制Caspase—3活性,并能显著降低细胞的凋亡数。用DMSO处理的精子共获得96只后代小鼠,其中4只为PCR检测阳性,2只能稳定传代目的基因,其脑黑质部、腹侧被盖区的CaBP-D28k表达量显著高于正常小鼠,而其海马、大脑皮层的CaBP-D28k表达量与正常鼠无明显差异,初步说明TH启动子能驱动外源CaBP-D28k基因在DA神经细胞中表达,获得了脑组织特异表达CaBP-D28k的转基因小鼠品系。MPTP造模试验结果表明,转基因鼠黑质致密部TH阳性细胞数和行为学变化差异不显著,而正常鼠黑质致密部TH阳性细胞数和行为学变化差异显著,表明脑内DA神经细胞中CaBP-D28k的过量表达具有抗MPTP损伤能力。