胎盘滋养层细胞(placental trophoblast cells)是构成胎盘屏障的重要组成部分,在哺乳动物胎盘形成和胎儿发育过程发挥重要的生理和免疫保护功能。猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)是引起母猪繁殖障碍性疾病的重要病原之一,且能通过胎盘屏障由母体垂直传播给胎儿。但是,目前关于PPV与胎盘滋养层细胞相互作用的机制还有待进一步深入研究。本研究首先以PK-15细胞作为细胞模型,分别从细胞形态学和分子生物学角度阐明PPV诱导PK-15细胞凋亡的机制,为研究PPV诱导猪胎盘滋养层细胞凋亡机制提供理论依据和技术支持。然后,体外分离培养原代猪胎盘滋养层细胞(porcine placental trophoblast cells,PTCs),并使其永生化。进一步用PPV分别感染原代PTCs和永生化PTCs,检测死亡受体通路和线粒体通路凋亡相关因子的变化。最后,通过滴鼻途径将PPV感染初孕母猪,在动物整体水平验证PPV诱导猪胎盘滋养层细胞凋亡机制。研究结果旨在通过探索PPV诱导PTCs凋亡的信号转导途径及其调控机制,为揭示PPV引起母猪繁殖障碍的致病机制奠定理论基础。研究取得以下结果。1.1.0 MOI剂量PPV感染PK-15细胞24 h后,细胞出现染色质固缩、核碎裂及形成凋亡小体等一系列细胞凋亡形态学变化特征。DNA片段化分析结果显示,PPV导致PK-15细胞内DNA降解为180~200 bp或其整数倍大小的基因片段。Annexin V FITC/PI双染流式细胞仪检测结果显示,PK-15细胞凋亡率在PPV感染后24 h为17.9%,与对照组相比差异极显著(p<0.01)。Caspase活性检测结果显示,PPV激活PK-15细胞的Cspase-9与Cspase-3,但并不影响caspase-8的活性。Western blotting分析PPV对PK-15细胞内死亡受体通路和线粒体通路凋亡相关因子的影响,结果显示,PARP在PPV感染12 h后发生降解,Fas、FasL、Bid及t Bid的表达量在整个PPV感染过程中均未出现显著变化,而p53蛋白于PPV感染后3 h开始积累,并在第15、20和46位丝氨酸位点进行磷酸化修饰,PK-15细胞内Bax表达水平在PPV感染后6 h明显升高,Bcl-2蛋白含量则逐渐下降,同时伴随着胞浆Bax向线粒体的转位和线粒体Cyt c的释放。p53抑制剂PFT-α可以有效的抑制PPV对PK-15细胞线粒体通路凋亡相关因子的诱导和激活作用。结果表明,1.0 MOI PPV感染PK-15细胞激活p53介导的线粒体通路,进而诱导PK-15细胞凋亡。2.采集妊娠30~50 d健康母猪的胎盘组织,利用胶原酶消化法和密度梯度离心法分离原代PTCs。显微镜下观察原代细胞呈上皮样形态单层贴壁生长,免疫组织化学染色结果表明,原代PTCs表达滋养层细胞特异性标记分子CK-7。为获得稳定的永生化PTCs,将外源性人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)基因转染到原代ptcs。rt-pcr和trap-elisa端粒酶活性检测结果显示,转染后ptcs中能够稳定表达htert基因,ptcs连续传代50次以后仍保持相对较高的端粒酶活性。细胞核型分析技术、软琼脂克隆试验及裸鼠致瘤性试验结果显示,转染后第30代和第50代的ptcs具有稳定的正常核型,不具有锚着非依赖性生长特性和裸鼠体内致瘤性。透射电镜观察结果显示,转染后第30代和第50代ptcs具有与原代细胞一致的细胞极化特性。westernblotting和rt-pcr检测发现,第30代和第50代ptcs中表达e-钙粘素,不表达非经典mhc-Ⅰ分子。放射免疫检测结果显示,转染后的ptcs具有分泌胎盘催乳素(pl)和绒毛膜促性腺激素β亚基(cg-β)的功能,并且分泌水平与原代细胞基本一致。结果表明,永生化猪胎盘滋养层细胞没有恶性转化特性,保留了原代ptcs的关键生物学特性,可以作为研究ptcs与ppv相互作用机制的细胞模型。3.以原代和永生化猪胎盘滋养层细胞为细胞模型,分别感染1.0moippv,在ppv感染后不同时间检测猪胎盘滋养层细胞凋亡信号分子的变化水平。细胞免疫荧光染色结果显示,ppv能够感染并在原代ptcs和htert-ptcs中大量复制。在ppv感染24h原代ptcs和htert-ptcs呈现细胞皱缩、变圆和脱落等典型的细胞病变效应,ao/eb染色结果显示,ppv感染的原代ptcs和htert-ptcs染色质浓缩、碎裂或聚集于核膜边缘,并伴有凋亡小体的形成,呈现典型的凋亡细胞形态学特征。经annexinvfitc/pi染色流式细胞仪检测显示,ppv感染的原代ptcs和htert-ptcs凋亡率显著高于阴性对照组细胞(p<0.05)。利用分光光度法检测原代ptcs和htert-ptcs中的caspase活性,结果显示,ppv感染12h后细胞中caspase-8、caspase-9和caspase-3活性均显著提高(p<0.05)。westernblotting分析结果表明,原代ptcs和htert-ptcs中caspase-3特异性切割底物parp在ppv感染后12h被剪切为小片段。原代ptcs和htert-ptcs中fasl蛋白表达水平于ppv感染后6h开始上调,fas表达量在整个ppv感染过程中均未出现显著变化,而bax表达量在ppv感染后6h明显增加,bcl-2蛋白表达水平则逐渐降低,该过程伴随着bax转位和cytc释放。原代ptcs和htert-ptcs中p53蛋白表达量于ppv感染后3h开始增加,并不断积累,同时发生磷酸化修饰,pft-α能够有效的抑制线粒体通路凋亡相关因子的表达和活化。研究结果表明,ppv感染原代ptcs和htert-ptcs激活细胞内fas/fasl死亡受体通路和p53介导的线粒体通路,进而诱导细胞凋亡。4.通过滴鼻感染初孕母猪1ml滴度为107tcid50/0.1ml的ppv病毒液,4周后组织病理学检测结果显示,胎盘滋养层细胞与子宫内膜上皮细胞分离,出现水肿和脱落等现象。ppv感染的胎盘滋养层细胞dna呈现凋亡特异性的片段化降解fas、fasl、bax及p53蛋白表达表达水平高于正常妊娠组,而bcl-2蛋白则低于正常妊娠母猪的胎盘滋养层细胞。研究结果表明,ppv感染妊娠母猪通过调控fas、fasl、bax、bcl-2和p53表达水平诱导胎盘滋养层细胞凋亡。本研究发现ppv通过激活p53介导的线粒体通路诱导pk-15细胞凋亡,建立了具有遗传、结构和主要生物学特性稳定的永生化猪胎盘滋养层细胞系。PPV感染原代和永生化猪胎盘滋养层细胞,通过激活细胞内Fas/Fas L介导的死亡受体通路和p53介导的线粒体通路诱导猪胎盘滋养层细胞凋亡。PPV人工感染初孕母猪试验进一步证实,PPV通过调控Fas、Fas L、Bax、Bcl-2和p53表达水平诱导胎盘滋养层细胞凋亡。PPV诱导猪胎盘滋养层细胞凋亡的分子机制分别在细胞水平和动物整体水平得以验证,将有助于深入揭示PPV引起母猪繁殖障碍的致病机制。