TαBTF3基因在小麦中的克隆及其功能研究

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本文采用cDNA末端快速扩增法(Rapid-amplification of cDNA ends,RACE),在小麦中首次克隆出BTF3基因(命名为TaB TF3)的序列全长,并采用VIGS(Virus-inducedgene silencing,VIGS)技术对其进行基因功能鉴定。  主要研究结果如下:  1.采用RACE-PCR技术从小麦中首次克隆到TaBTF3基因,其cDNA序列全长882bp,最大ORF序列为534bp,该基因编码一个由177个氨基酸组成的蛋白,预测分子量为20KD。基因组DNA序列全长1742bp,包含5个外显子、4个内含子,内含子和外显子的剪切位点严格符合GT/AC规律。实时定量PCR检测表明,TaBTF3在小麦根、叶、叶鞘、旗叶和幼穗中均有不同程度的表达,在旗叶中表达量最高,且受PEG、冷(4℃)、NaCl、MeJA、ABA和SA诱导上调表达。蛋白亚细胞定位结果表明,TaBTF3蛋白主要定位于细胞核与细胞质。Southern杂交结果显示,TaBTF3是多拷贝基因,以多拷贝的形式存在。  2.选用大麦条纹花叶病毒(BSMV)载体,在豫麦34中成功沉默报告基因TaPDS(小麦八氢番茄红素脱氢酶基因),TaPDS-VIGS小麦植株叶片呈现明显的光漂白表型。GFP蛋白荧光检测结果表明,在BSMV-GFP植株的叶片与根系中均可以检测到较强的GFP荧光信号,BSMV诱导的基因沉默是系统性沉默,并不仅仅局限于接种叶片。高效稳定的小麦VIGS技术体系的成功建立,为小麦TaBTF3基因功能分析验证提供了技术平台。  3.成功获得TaBTF3-VIGS植株与BSMV-GFP对照植株,并对BSMV-VIGS植株进行鉴定、生理指标检测。沉默TaBTF3基因导致叶绿素含量降低、MDA与H2O2含量显著升高。通过荧光定量PCR检测线粒体、叶绿体编码基因的表达量变化,结果表明,与BSMV-GFP对照植株相比,沉默TaBTF3基因导致线粒体、叶绿体编码基因的表达量显著下降。进一步采用石蜡切片技术观察TaBTF3-VIGS植株叶肉细胞的变化,结果显示,与对照相比,TaBTF3-VIGS植株的叶肉细胞发育异常、体积变小、排列松散、无序、胞间隙较大。由此表明,TaBTF3可能与线粒体、叶绿体和叶肉细胞的生长发育有关。  4.通过荧光定量PCR检测小麦逆境相关基因的表达量,并对TaBTF3-VIGS植株与BSMV-GFP对照植株进行胁迫耐受性检测。结果表明,在正常生长条件下,沉默TaBTF3基因导致逆境相关基因的表达被抑制。逆境胁迫处理结果显示,TaBTF3-VIGS植株的相对电导率与失水率显著高于对照,而相对含水量与游离腩氨酸含量则明显降低。沉默TaBTF3降低了小麦植株对干旱和冻害胁迫的耐受性。这些结果表明,TaBTF3参与了植物逆境胁迫耐受性过程。
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