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目的1.体外对人小涎腺上皮干/祖细胞(hMSG-EpiPCs)进行成肝诱导,鉴定诱导获得细胞的表型和检测其是否具有成熟肝脏细胞相关功能。2.移植hMSG-EpiPCs给急性肝损伤模型小鼠,鉴定其对小鼠急性肝功能损伤的修复能力,评估移植细胞成活率及肝内转归。方法1.利用组织块贴壁法从人小涎腺组织中分离培养出上皮干/祖细胞,体外传代扩增培养。利用免疫荧光和流式细胞术鉴定其干细胞表型和特异性标记物。体外Matrigel构建三维培养环境下对hMSG-EpiPCs进行成肝诱导并设立空白对照组。利用免疫荧光及Real-time PCR检测诱导而来的细胞相关肝脏细胞表型表达,并通过PAS染色、ICG摄取和CYP450功能测定检测其相关成熟肝脏细胞功能。2.使用CM-Dil荧光标记hMSG-EpiPCs并观察标记后细胞生长情况。建立联合免疫缺陷(SCID/Beige)小鼠20%CC14腹腔注射急性肝损伤模型,随机分为两组:实验组移植hMSG-EpiPCs(n=12),对照组注射PBS(n=12),另取正常SCID小鼠作为空白对照组(n=3)。术后观察小鼠体重变化。并于移植后1天、3天、1周及2周分别取材。检测小鼠血清中人血清白蛋白含量和肝功。对取材肝脏组织进行HE染色和肝细胞表型免疫荧光鉴定,观察炎症反应和注射细胞存活及转归情况。结果1.成功分离培养获得人小涎腺上皮干/祖细胞。该细胞生长良好,呈铺路石状。免疫荧光及细胞流式分析表明,获得的hMSG-EpiPCs表达CD29、CD49f、ABCG2、PLET-1及细胞角蛋白等上皮干/祖细胞标记、涎腺上皮细胞标记CD44及CD166、人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)、胸腺上皮祖细胞标记物K5和K8、内皮细胞标记物CD31、基底膜黏蛋白(LAMININ)及Wnt信号通路标记LGR5和LGR6,部分表达胚胎干细胞标记SOX2。hMSG-EpiPCs在体外三维培养环境下可诱导向肝细胞样细胞分化。诱导而来细胞表达肝细胞标记蛋白ALB、CK18、CYP3A4和AAT,不表达AFP。ICG摄取和PAS染色均为阳性。CYP3A4和CYP2C19功能检测阳性。2.CM-Dil红色荧光标记hMSG-EpiPCs生长状况好。实验组小鼠体重恢复速度比对照组快,肝重-体重比值更低,ALT、AST及TBIL下降速度与下降程度显著优于对照组。两周后实验组小鼠血清中可检测到HSA。肝脏病理切片显示,实验组小鼠一周后肝脏病变已基本恢复正常,而对照组小鼠一周后肝脏仍有病变肝细胞。肝脏组织切片显示,两周后实验组有红色荧光标记hMSG-EpiPCs存活,表达肝细胞相关标记AFP、ALB和CK18。结论1.hMSG-EpiPCs可在体外成肝诱导分化为肝细胞样细胞,表达相关表型,并具有一定的肝细胞功能。2.移植hMSG-EpiPCs可促进急性肝损伤模型小鼠的肝脏功能恢复,移植细胞存活并参与病变肝脏组织修复重建。