目的胃癌和结肠癌是常见的消化道系统恶性肿瘤,发病率和死亡率较高。尽管临床上对胃肠道肿瘤采取了手术、放疗、化疗、生物治疗等综合治疗措施,但治疗效果差,仍有相当数量的患者最终死于癌灶的复发和转移,给社会和家庭带来了沉重的经济及精神负担。β1,3-N乙酰氨基葡萄糖基转移酶Ⅷ(β3Gn T8)以UDP-Glc NA为供体,将Glc NAc添加到三天线N-聚糖Galβ1-4Glc NAc的非还原性末端形成多聚乳糖胺型糖链。本课题从基因到糖链、从细胞内到细胞外等多个层次和水平上,通过对糖基转移酶β3Gn T8、多聚乳糖胺型N-糖链展开系统研究,以阐释β3Gn T8调控胃癌侵袭转移和结肠癌化疗耐药的分子机制。方法(1)研究β3Gn T8调控胃癌细胞侵袭转移的分子机制(1)运用胃癌组织芯片采用免疫组化染色观察β3Gn T8、多聚乳糖胺的表达,并将结果与患者临床病理参数进行统计分析,进而阐明β3Gn T8、多聚乳糖胺的表达水平与胃癌患者临床病理特征的关系。(2)培养不同来源的三种胃癌细胞株(AGS、SGC-7901、NCI-N87),通过Tanswell侵袭实验和划痕修复实验,比较各实验细胞的侵袭性和迁移性;采用荧光定量PCR和Western blot技术,检测β3Gn T8在各胃癌细胞中的表达高低;采用流式细胞术、Lectin blot、凝集素芯片技术,分析多聚乳糖胺在各胃癌细胞中的表达、结构和功能特点,进而阐明β3Gn T8、多聚乳糖胺的表达与胃癌细胞侵袭转移潜能的关系。(3)通过基因转染和RNA干扰技术靶向调控相应胃癌细胞中β3Gn T8的表达,采用流式细胞术和Lectin blot技术,检测多聚乳糖胺的表达;通过Transwell实验比较各实验细胞的侵袭能力;采用Western blot技术,检测糖蛋白CD147糖基化修饰改变;采用荧光定量PCR、Western blot,分析基质金属蛋白酶MMPs的表达变化,进而阐明β3Gn T8对胃癌细胞侵袭转移的调控机制。(4)采用免疫沉淀技术富集胃癌细胞中β3Gn T8的相互结合蛋白,通过SDSPAGE对免疫沉淀复合物进行分离。然后从胶中切取染色明显的蛋白条带,经过脱色、还原、烷基化、酶解等处理,进行质谱分析。搜索SWISS-PROT数据库,进而筛选和鉴定胃癌细胞中β3Gn T8的靶蛋白。(5)采用PNGase F酶解释放胃癌细胞中总糖蛋白N-糖链,对所得N-糖链用Sep-Pak C18柱纯化后进行完全甲基化衍生,质谱解析N-糖链的结构轮廓,进而阐明胃癌细胞中N-糖链变化规律。(2)研究β3Gn T8调控结肠癌细胞化疗耐药的分子机制(1)采用荧光定量PCR技术检测β3Gn T8在结肠癌5-氟尿嘧啶(5-FU)耐药细胞SW620/5-FU及其母细胞SW620中的表达水平;采用流式细胞术、Lectin blot检测多聚乳糖胺在SW620/5-FU及SW620中的表达特征,进而阐明β3Gn T8、多聚乳糖胺的表达与结肠癌细胞化疗耐药的关系。(2)通过RNA干扰技术抑制SW620/5-FU细胞中β3Gn T8的表达,采用流式细胞术、Lectin blot检测多聚乳糖胺的表达改变;采用MTT药物敏感性实验检测细胞耐药性状的改变;采用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡;采用PI单染检测细胞周期,进而阐明β3Gn T8对结肠癌细胞化疗耐药的调控机制。(3)通过多聚乳糖胺合成抑制剂3’-叠氮胸苷(AZT)干预SW620/5-FU细胞中多聚乳糖胺的合成,采用MTT药物敏感性实验检测细胞耐药性状的改变,进而阐明多聚乳糖胺对结肠癌细胞化疗耐药的调控机制。结果(1)β3Gn T8高表达通过诱导多聚乳糖胺的合成进而促进胃癌细胞侵袭转移(1)β3Gn T8阳性产物主要定位于胃癌组织细胞的胞核和胞浆中,呈棕黄色颗粒状分布。多聚乳糖胺阳性表达主要集中在胃癌组织细胞的胞浆,表现为胞浆内呈现棕黄色或者棕褐色颗粒,也有少量为胞膜中呈现棕黄色。胃癌患者中β3Gn T8的表达与年龄、性别、分化程度无明显相关性,但是与肿瘤的病理分级和临床分期正相关。胃癌患者中多聚乳糖胺的表达与肿瘤病理分级和临床分期存在正相关,而与年龄、性别、分化程度不具有相关性。β3Gn T8、多聚乳糖胺在胃癌组织中的表达强度呈正相关关系。(2)胃癌AGS细胞的侵袭转移能力最强,其次是SGC-7901细胞,而NCI-N87细胞的侵袭转移能力最弱。AGS细胞中β3Gn T8基因和蛋白表达最高,其次是SGC-7901细胞,而NCI-N87细胞中β3Gn T8基因和蛋白表达最低。AGS细胞中多聚乳糖胺含量最多,其次是SGC-7901细胞,而NCI-N87细胞中多聚乳糖胺含量最少。β3Gn T8、多聚乳糖胺在胃癌细胞中的表达水平存在一致性。(3)上调胃癌NCI-N87细胞中β3Gn T8的基因表达,多聚乳糖胺的含量上升,细胞侵袭能力增强,高糖基化(HG)-CD147表达升高,MMP-14的基因和蛋白表达增多。下调胃癌AGS细胞中β3Gn T8的基因表达,多聚乳糖胺的含量下降,细胞侵袭能力减弱,高糖基化(HG)-CD147表达降低,MMP-14的基因和蛋白表达受到抑制。(4)在胃癌AGS细胞中,共分离鉴定出45种可与β3Gn T8相互结合的蛋白;在NCI-N87细胞中,共分离鉴定出32种可与β3Gn T8相互结合的蛋白。通过对比分析,发现AGS和NCI-N87细胞中存在23种可与β3Gn T8结合的共有蛋白。针对这些蛋白进行功能研究,并结合免疫共沉淀技术,发现膜联蛋白A2(annexin A2,ANXA2)是β3Gn T8潜在靶蛋白。(5)胃癌AGS、SGC-7901、NCI-N87细胞中所含的N-糖链种类没有明显差别,但存在量上的差异。AGS细胞中岩藻糖和唾液酸的N-糖链含量均很少;SGC-7901细胞中岩藻糖的N-糖链所占比例明显高于其他两种细胞;NCI-N87细胞中唾液酸的N-糖链所占比例明显高于其他两种细胞。(2)β3Gn T8高表达通过诱导多聚乳糖胺的合成进而促进结肠癌细胞耐药(1)与结肠癌SW620细胞相比,耐药细胞SW620/5-FU中β3Gn T8的表达和多聚乳糖胺的含量均明显增加。(2)抑制SW620/5-FU细胞中β3Gn T8的基因表达,多聚乳糖胺的含量下降,对化疗药物5-FU的敏感性上升,细胞凋亡增多,G1期细胞减少,而S期和G2/M期细胞增加。(3)AZT可有效抑制SW620/5-FU细胞中多聚乳糖胺的合成,提高其对化疗药物5-FU的敏感性。结论(1)β3Gn T8、多聚乳糖胺在胃癌组织中高表达,且均与胃癌患者的病理分级和临床分期有关联,二者在胃癌组织的表达具有正相关性,提示其与胃癌的恶性进展有密切关系。随着胃癌细胞侵袭转移能力的增强,β3Gn T8的表达和多聚乳糖胺的含量也随之升高。β3Gn-T8通过催化CD147分子中多聚乳糖的合成调控MMP-14的表达,从而改变胃癌细胞侵袭转移能力,这可能需要ANXA2的协同作用。此外,N-糖链表达异常也与其胃癌细胞恶性表型有关。(2)β3Gn T8和多聚乳糖胺在结肠癌5-FU耐药细胞中高表达。抑制β3Gn T8的表达和多聚乳糖胺的生物合成,可增强结肠癌耐药细胞对5-FU的敏感性,实现其耐药性的逆转。总之,β3Gn T8及多聚乳糖胺在调控胃肠道肿瘤侵袭转移和化疗耐药过程中起着关键作用。这一研究为针对胃肠道肿瘤治疗相关分子药物设计、筛选提供新的靶点,为临床个体化治疗提供基础,具有重要的科学意义和实用价值。