气血理论为中医学的核心理论之一,气血辨证是中医临床治疗疾病的重要方法,根据脏腑的气血盛衰对机体功能状态做出判断,和中医八纲辨证、脏腑辨证等互参互用,形成了中医学认知疾病的重要途径。气虚血瘀证是许多慢性疾病发展到某个阶段的常见证候,气虚所导致的乏力、懒动等运动能力减低表现为临床诊断气虚血瘀证所不可或缺的常见条件。目前基于气虚血瘀证候的代谢组学研究较少,对该证候进行代谢组学研究,有利于更好地预防和治疗这些疾病,量化临床诊断指标,为预防及发现疾病提供客观依据。补阳还五汤由黄芪、川芎、当归、红花、赤芍、桃仁、地龙七位药组成,是中医治疗气虚血瘀证的经典方剂。益气活血颗粒是国家973计划“基于病证结合的气血相关理论研究”项目的益气活血方,来源于补阳还五汤,其在药味组成上与补阳还五汤完全一致,但在药味配比上做了调整。目的本研究旨在采用代谢组学的方法,挖掘脑梗死、心衰两种不同疾病同属于气虚血瘀证的共性及特异性变化物质,从代谢组学的角度,阐明中医证型的物质基础,为气虚血瘀证的中医辨证微观化提供理论依据。方法本研究旨在采用代谢组学的方法,以气虚血瘀证脑梗死患者、冠心病心衰患者及相对应的气虚血瘀证脑梗死大鼠、缺血性心力衰竭大鼠为研究对象,课题分为四部分:第一、三部分为气虚血瘀证脑梗死、冠心病心衰患者血清样本的代谢组学研究。应用代谢组学技术分别对气虚血瘀证脑梗死、冠心病心衰患者与益气活血颗粒给药后的患者血清进行研究,探寻与气虚血瘀证临床证候和临床疾病相关的生物标志物,解释相关的生物功能,为临床诊断提供客观指标。通过中药复方益气活血颗粒对上述病证的治疗作用,明确是否通过调节相关的生物代谢途径发挥作用,如果生物标志物与中药的干预呈现相关性,也有利于进一步验证生物标志物的可靠性。第二、四部分为对气虚血瘀证脑梗死、缺血性心衰动物模型进行系统的代谢组学研究。采用微球致多发性脑梗合并水平台不完全睡眠剥夺法建立大鼠气虚血瘀证脑梗死模型,采用睡眠剥夺复合冠状动脉左前降支结扎建立大鼠气虚血瘀证缺血性心衰模型。代谢组学分析的范围为血液样本或组织样本,挖掘相关生物标志物,尤其是与气血理论相关的能量代谢、氧化损伤等途径的代谢物,同时观察相应代谢通路的变化,从而验证病证结合动物模型与临床病证的一致性及更进一步揭示病证的发生、发展过程和机理。结果1.气虚血瘀证脑梗死患者的代谢组学研究:模式识别结果显示安慰剂组和给药组呈现显著分离,分别找出两组之间相关的差异物质。结果发现,给药组相较于模型组中Histidine、Glycylproline、Leucine、Gentamicin、Pyroglutamic acid、Proline 含量显著下降,主要涉及脂质代谢、组氨酸代谢、鞘磷脂代谢等代谢通路的变化。2.气虚血瘀证脑梗死大鼠的代谢组学研究:采用睡眠剥夺复合微球致多发脑梗建立气虚血瘀证脑梗大鼠模型,药理指标检测结果提示模型组造模成功且与正常对照组比较差异显著,与正常对照组相比,模型组体质量、抓力、脉搏幅度显著下降,负重游泳时间明显缩短。代谢组学结果通过模式识别发现模型组和正常组的代谢轮廓有明显差异,检测出21个与气虚血瘀证脑梗疾病相关的生物标志物,其中有16种生物标志物受到益气活血颗粒的显著回调。与假手术组相比,模型组中Citrulline,Glycylproline,Isobutyryl carnitine,Lysine,Diaminopimelic acid,Ornithine,Asparagine,Linolenoyl lysolecithin 含量显著升高,Glycylproline,Pyroglutamic acid,Pipecolic acid含量显著降低,主要涉及能量代谢、炎症反应和精氨酸代谢。在气虚血瘀证脑梗疾病的代谢组学研究中,动物和临床的结果中均检测到Pyroglutamic acid,Pipecolic acid,7,8-Diaminononanoate,1-Linoleoyl phosphatidylcholine,Glycylproline,Arachidonyl lysolecithin说明建立的气虚脑梗动物的模型能够基本上反映气虚脑梗临床患者的病理状态,这个模型和临床是密切相关的。3.气虚血瘀证冠心病心衰患者的代谢组学研究:模式识别结果显示安慰剂组和给药组呈现显著分离,分别找到两组之间相关的差异物质。结果发现,给药组相较于模型组中 Leucine,Isobutyryl carnitine 等含量显著降低,18-oxo-nonadecanoic acid 含量显著升高,主要涉及到能量代谢、脂肪酸氧化和磷酸胆碱代谢。4.气虚血瘀证缺血性心衰大鼠的代谢组学研究:采用睡眠剥夺复合冠状动脉左前降支结扎方法建立气虚血瘀证缺血性心衰大鼠,结果显示模型组大鼠体重和脉搏幅度降低、腹主动脉血流速度降低,并且心功能指标表明模型成功,代谢组学结果通过模式识别发现模型组和正常对照组的代谢轮廓有明显差异,并检测出25个与气虚血瘀证心衰疾病相关的生物标志物,其中有21种生物标志物受到益气活血颗粒的显著回调。与正常对照组相比,模型组中 Homocamosine,Glutathione,Pyroglutamic acid,Niacinamide,Pyruvic acid,Stearic acid,Pantothenic Acid,Creatine 含量显著降低,Indoleacrylic acid,Proline,Alanine,Leucine,Asymmetric dimethylarginine(ADMA)含量显著升高,主要涉及到精氨酸代谢、能量代谢、嘌呤代谢和脂肪酸氧化代谢通路的变化。在气虚血瘀证心衰疾病的代谢组学研究中,动物和临床的结果中均检测到Leucine和Isobutyrylcarnitine,且两种标志物在临床患者和动物模型中给药组相较于模型组均下调。说明建立的气虚心衰动物模型能够基本反映气虚心衰临床患者的病理状态,这个模型和临床是密切相关的。5.气虚血瘀证同证异病存在共性标志物:筛选四组代谢组学结果发现,四组中出现2次以上的生物标志物共计12种,这些共有的差异代谢物在四组结果中彼此验证,更加确定了其与气虚血瘀证的相关性。对这些共有的差异代谢物涉及的生物学途径进行分析发现,气虚血瘀证发生发展密切相关的生物学途径包括能量代谢系统、血管内皮系统。6.气虚血瘀证同证异病存在特异性标志物:(1)气虚血瘀证脑梗死患者组与气虚血瘀证脑梗死大鼠组共有20种生物标志物是气虚血瘀证心衰疾病所不具有的,其中有4种为二者共有。此外我们发现气虚血瘀证脑梗死疾病所特有的生物标志物中有组氨酸,组氨酸为具有神经保护作用组胺的前体物质。(2)气虚血瘀证心衰患者组与气虚血瘀证心衰大鼠组共有17种生物标志物是气虚血瘀证脑梗疾病所不具有的,其中包括表征心功能不全的ADMA和肌酸。结论1.本研究中建立的气虚血瘀证脑梗动物模型与临床气虚血瘀证脑梗患者密切相关,它们的共同标志物为包括焦谷氨酸、高脯氨酸、甘氨酰脯氨酸等在内的6种物质。本研究中建立的气虚血瘀证心衰动物模型与临床气虚血瘀证心衰患者密切相关,它们的共同标志物为亮氨酸和异丁肉碱,且这两种标志物在临床和动物模型中给药组相较于模型组均有下调。2.通过对气虚血瘀证心衰和气虚血瘀证脑梗两种不同疾病的代谢组学结果比较,发现气虚血瘀证可能与能量代谢、血管内皮系统相关代谢通路密切相关。3.气虚血瘀证脑梗疾病的特异性标志物为具有神经保护作用的组胺前体物质:组氨酸;气虚血瘀证心衰疾病的特异性标志物为表征心功能不全的非对称性二甲基精氨酸和肌酸。