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水稻白叶枯病是危害最为严重的水稻细菌性病害,在世界各地都有发生。该病害不能通过传统的化学方法有效防治,利用抗性品种自身携带的抗病基因进行抗性育种,挖掘持久抗性的抗病基因以及组合多个抗病基因,才能真正解决多变的病原菌的威胁。这些策略的实现,都是以高效快速地获得抗病基因为前提的。传统克隆抗病基因的方法步骤繁多、费时费力,亟需深入了解抗病基因的有关分子机制及遗传演化规律,开拓高效筛选抗病基因的新思路。 水稻白叶枯病抗性基因种类多样,其中包括三种主要的类型:LRR-RLK,NBS-LRR以及SWEET基因家族。我们已经对LRR-RLK和NBS-LRR类型基因的抗性机制及遗传进化进行了深入的研究和报道。对于研究相对较少的SWEET水稻白叶枯病基因家族,本研究我们首次在全基因组范围内,对28个植物物种中该类型的基因进行了系统性的进化分析。这28物种包括了从低等水生到高等陆生的不同植物。该类基因曾被发现具有转运糖的作用,被简单的认为是进化保守的基因家族。在我们的研究中,显著的基因扩增现象在高等陆生植物中发现,而这些扩增所涉及到的基因复制模式在系谱甚至物种之间都不相同。另外我们采用最大似然法构建了SWEET基因的系统进化树,并且可以将其分成四个保守的大的进化枝。这些进化枝又被进一步地分为了9个单子叶和10个双子叶的基因家族。通过对这些基因家族遗传参数的计算,我们发现两种进化速率的SWEET基因,即保守的和快速进化的。保守的SWEET基因的拷贝数单一、不同物种间的成员有明确的直系同源关系及低的进化速率;而快速变异的SWEET基因不同物种间的拷贝数差异大、遗传变异丰富,包括高的核苷酸差异度以及遗传重组率,并经受正选择作用力。而三个已鉴定的SWEET类型的抗病基因属于同一个快速变异的基因家族,在进化树上成簇存在。而这些典型的分子特征,如拷贝数目的变化、高的遗传变异及正选择压力等成为我们选择抗病基因的标准。 其次,笔者所在实验室以植物抗病基因遗传演化规律为基础,建立一套全新的植物抗病基因的高通量克隆方法,并以水稻抗稻瘟病的高通量克隆为例证,证明了该方法的高效性与可行性。在本研究中,我们利用相同的方法,在全基因组范围内大规模地筛选了82个LRR-RLK类型和6个SWEET类型的抗病基因候选位点,从8个具有不同抗性的水稻品种中克隆了包含32个位点的119个LRR-RLK基因,以及4个位点的10个SWEET基因。目前,已完成了大部分LRR-RLK基因在水稻品种TP309中的遗传转化,获得了98个LRR-RLK基因的近等基因系。而在之前的研究中我们已通过该方法得到了160个NBS-LRR基因的TP309近等基因系。我们利用五个不同的抗白叶枯病小种,对这些NBS-LRR和LRR-RLK基因的水稻转基因系分别进行抗性评估。最终我们筛选到了包含17位点的19个NBS-LRR基因对一个或者多个白叶枯病小种具有显著的抗性改善,有5个NBS-LRR基因具有普遍抗性。对于70个LRR-RLK转基因系的初步鉴定结果,筛选到了30个LRR-RLK基因存在抗性改良的情况,并且其中的12个基因对两个及两个以上的小种有抗性改善的表现。