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肝纤维化是一种严重危害人类健康的疾病，是慢性肝病发展过程的共有病理特征，防治和逆转肝纤维化是控制慢性肝病的关键。目前治疗肝纤维化手段仍不尽人意，寻找新的抗纤维化药物，并了解其作用机制是当务之急。黄芪总苷（Astragalosides，AST）是从黄芪中提取的有效部位，本室多年来研究发现，AST具有抗炎、抗氧化、免疫调节、抗肝损伤和抗肝纤维化等作用，而且无明显的毒副作用。我们在初步研究AST抗肝纤维化作用的基础上，采用体内体外相结合的方法，分别从整体、细胞及蛋白质和核酸分子水平上，进一步研究了AST的抗肝纤维化作用及其机制。 1．AST对HSC功能的抑制作用 利用肝星状细胞株HSC-T6，采用3H-TdR和3H-脯氨酸掺入法，建立了血清、KCCM和细胞因子（PDGF-BB、TGF-β1）体外刺激HSC-T6细胞增殖和合成胶原的模型。研究了AST体外抑制HSC-T6细胞增殖和胶原合成的量效和时效关系。结果显示：（1）AST(32～256mg．L-1)对血清（10％NBS+3％大鼠血清）刺激HSC-T6细胞，呈浓度和时间依赖性抑制增殖；AST(16～256mg．L-1)对血清刺激HSC-T6细胞，呈浓度和时间依赖性抑制胶原合成；（2）AST(8、16、32、64和128mg·L-1)对KCCM（1：4）或PDGF-B(10μg·L-1)刺激HSC-T6细胞，呈浓度依赖性抑制安徽医科大学博士学位论文增殖;（3）AsT（s一256mg·L一，）对KeeM（l:4）或TGF一p一（2林g·L一‘）刺激HSC一T6细胞，呈浓度依赖地抑制胶原合成。提示，AST抑制HSC的功能与其直接抑制PDGF促增殖和TGF一pl促胶原合成的作用有关。此外，AST（8一128mg.L一l）对血清刺激Hsc一T6和NIH3T3细胞的半数抑制浓度IC5o分别为62 mg.L一’和1l7mg.L’‘，提示，AsT对Hsc一T6细胞的抑制效应有一定的选择性。2.AST抑制PDGF和TGF一pl的作用与其减少肝组织和HSC表达PDGF和TGF一pl及其相应受体有关 在AsT3个剂量（20、40、somg.kg一’.d一’，19，4一13诫）和^sT（somg.kg.’.d一’，19）全程（0lowk）、早期（4一10wk）和晚期（8一10Wk）3种给药方案有效防治CCI;致大鼠肝纤维化的基础上，采用组织芯片技术对纤维化肝组织进行了PicTure二步法免疫组织化学（IHc）和免疫细胞化学（l CC）定量分析。结果显示，AST均能抑制CCI;升高的肝组织PDGF一B、TGF一pl及其受体PDGFR一p、TGFpRI的表达。AsT（16、64和128 mg.L一，）作用48小时，可浓度依赖性抑制Hsc一T6细胞PDGF一B、TGF一pl及其受体PDGFR一p、TGF p Rl的表达。表明AST抑制PDGF和TGF一pl对HSC的促进作用，可能与其减少肝组织和HSC表达PDGF一B、TGF一pl及其受体有关。3.AS丁影响HSC细胞周期和促进HSc凋亡 结合形态学（光镜、电镜）、Tl一JNEL染色法和FACS检测AST对HSC一T6细胞生长周期和诱导凋亡的作用。结果显示，AsT（16、64和128mg.L’’）作用48一72小时均可诱导HSC一T6细胞凋亡，提示AST通过诱导细胞凋亡而减少活化HSC数量。 AsT（16、64和128 mg.L一l）作用45一72小时使处于增殖状态的Hse一T6细胞周期各峰值左移，随药物浓度的增高，首先呈现GZ从期比率明显减少和延缓S期细胞进入GZ舰期，随着作用时间的延长，GO/G;期阻滞作用逐渐明显。提示安徽医科大学博士学位论文AST引起细胞周期转换过程的障碍，导致HSC细胞发生了凋亡。4.AS丁对Hsc核转录因子NF KB的影响 在CCI;性大鼠肝纤维化组织和活化的HSC一T6细胞中，细胞核和细胞质内都有较强的NF K B p65阳性信号，AST不仅使肝组织的NF K B p65含量明显下降，而且明显降低HSC一T6细胞核和细胞质内的染色强度，表明AST有抑制HSC等细胞内NF KB含量和活性的双重作用，并进而限制HSC细胞周期转换，诱导细胞凋亡。5.AS丁对肝组织和HSc细胞凋亡相关基因蛋白表达的影响 AsT（40、somg.kg一’.d一’）4一13欣治疗和AsT（somg.kg.l.d一’）o一10叭给药组对大鼠ccl;性肝纤维化产生药效时，肝组织表达caspase一3均明显高于模型组。AsT（64、2 Zsmg.L”）体外亦可明显提高Hse一T6细胞easpase一3表达。提示AsT有诱导HSC表达casPase一3的作用。AST还能提高纤维化肝组织和激活HSC一T6细胞的bax表达，下调bel一2蛋白表达，使bel一2巧ax比值下降。提示AST上调bax和下调bel一2，使bcl一2/bax比值下降，进而通过细胞色素C激活caspase一3，促进HSC凋亡。但本研究中AST作用后均未发现明显的CDg，表达改变，提示，CD95可能不是AST对HSC作用的主要靶点。6.AST调节肝组织和HSC中MMP13及其抑制因子T 1 MP一1的表达 在大鼠CCI;性纤维化肝组织中，MMP13和TIMP一1分别呈明显的低表达和高表达;AsT3个剂量（20、40、somg.kg一’.d一’，4一13诫）治疗和AsT（somg.kg’‘.d’I）010wk给药均可使肝组织表达MMP13明显增高和TIMP一1表达下降，MMP 13/T IMP一1比值明显增加，提示AST通过调节纤维化肝组织中MMP13和TIMP一1的异常表达而提高MMP13/TIMP一1比值，加速ECM分解，发挥抗肝纤维化和使肝纤维化逆转的作用。AST体外亦可使血清或TGF一pl激活的HSC一T6细安徽医科大学博士学位论文胞MMP13蛋白表达明显提高，TIMP一1蛋白表达则明显下降;用RT一PCR技术检测结果显示，TI