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目的:基于miRNA-146a介导TLR4信号通路,研究蠲痹胶囊对骨性关节炎成纤维样滑膜细胞及软骨下成骨细胞免疫炎症反应的影响,探讨补肾益气方蠲痹胶囊治疗早期骨性关节炎的分子机制。方法:(1)取20只普通级5月龄雌性未孕豚鼠,利用其自发性OA的生物学特点,建立原发性豚鼠OA模型,采用胰蛋白酶-Ⅰ型胶原酶联合消化法,分离培养成纤维样滑膜细胞和软骨下成骨细胞,并制作细胞爬片,通过HE染色,显微镜下观察细胞的形态学特点,免疫组化、免疫荧光染色检测成纤维样滑膜细胞中Vimentin、CD90、CD55、CD68的表达情况以及偶氮偶联法碱性磷酸酶染色检测软骨下成骨细胞中碱性磷酸酶活性,对分离提取的成纤维样滑膜细胞和软骨下成骨细胞进行鉴定。(2)取32只普通级5月龄雌性未孕豚鼠,随机分为假手术组、模型组、蠲痹胶囊组、安必丁组,共4组,每组8只;其中模型组、蠲痹胶囊组、安必丁组均手术切除双侧卵巢,结合豚鼠自发膝骨性关节炎的生物特性,建立绝经后肾虚模型KOA的复合模型,而假手术组手术切除卵巢周围同等大小体积的脂肪组织;4组豚鼠手术结束继续喂养30天后,开始灌胃干预,其中蠲痹胶囊组及安必丁组分别给予蠲痹胶囊及安必丁胶囊水溶剂灌胃,假手术组及模型组则给予等量蒸馏水灌胃,连续灌胃5日后经腹主动脉采血分离提取假手术组、模型组、蠲痹胶囊组、安必丁组豚鼠血清;用制备好的各组血清分别干预培养成纤维样滑膜细胞及软骨下成骨细胞,连续干预5天后,分别提取各干预组成纤维样滑膜细胞及软骨下成骨细胞的RNA及蛋白质,并收集各组干预结束时的细胞培养液,离心制取细胞上清液;Elisa测定成纤维样滑膜细胞及软骨下成骨细胞的细胞上清液中IL-1β、MMP-13、TNFα水平,RT-PCR检测细胞内micro RNA-146a、TLR4、My D88、TRAF6、NF-κBp65、TNFα的基因表达情况,应用SPSS 21.0统计软件对实验所得数据进行统计学分析。结果:(1)实验分离提取的成纤维样滑膜细胞镜下观大多呈不规则梭形、类三角形、多边形,卵圆形的细胞核位于细胞中央,从形态学上观察符合成纤维样膜细胞的特征,免疫组化以及免疫荧光染色结果显示Vimentin、CD90、CD55均为强阳性表达,CD68为表达呈阴性,证实了其为实验所需的成纤维样滑膜细胞;实验分离提取的软骨下成骨细胞镜下观形态多样,大多呈长梭形、三角形,细胞核呈卵圆形沿细胞长轴分布,从形态学上观察符合成骨细胞的特征,偶氮偶联法碱性磷酸酶(ALP)染色结果呈强阳性,证实其为实验所需的软骨下成骨细胞。(2)Elisa测定假手术组与模型组豚鼠血清中雌激素水平,结果显示:假手术组豚鼠血清E2平均浓度为(76.24±3.73)ng/L,而模型组豚鼠血清E2平均浓度为(45.39±4.38)ng/L,模型组较假手术组明显降低,P<0.05,证明模型组豚鼠卵巢被切除后,雌激素水平较假手术组显著下降;Elisa测定成纤维样滑膜细胞的细胞上清液中IL-1β、MMP-13、TNFα水平,结果显示:模型组与假手术组比较,模型组细胞上清液IL-1β、MMP-13、TNFα水平均明显升高,P<0.05,蠲痹胶囊组及安必丁组分别与模型组比较,蠲痹胶囊组及安必丁组细胞上清液IL-1β、MMP-13、TNFα水平均明显降低,P<0.05,蠲痹胶囊组与安必丁组比较无差异,P>0.05;Elisa测定软骨下成骨细胞的细胞上清液中IL-1β、MMP-13、TNFα水平,结果显示:模型组与假手术组比较,模型组细胞上清液IL-1β、MMP-13、TNFα水平均明显升高,P<0.05;蠲痹胶囊组及安必丁组分别与模型组比较,蠲痹胶囊组及安必丁组细胞上清液IL-1β、MMP-13、TNFα水平均明显降低,P<0.05;蠲痹胶囊组与安必丁组比较无差异,P>0.05。(3)成纤维样滑膜细胞RT-PCR检测结果显示:模型组与假手术组相比较,模型组成纤维样滑膜细胞中TLR4、My D88、TRAF6、NF-κBp65、TNFα的表达均上调,而模型组mi RNA-146a表达明显下调,有显著性差异,P<0.05,蠲痹胶囊组及安必丁组分别与模型组比较,成纤维样滑膜细胞中TLR4、My D88、TRAF6、NF-κBp65、TNFα的表达均下调,而mi RNA-146a表达明显上调,有显著性差异,P<0.05,蠲痹胶囊组与安必丁组比较,成纤维样滑膜细胞中TLR4、My D88、TNFα表达有显著差异,P<0.05,而TRAF6、NF-κBp65表达无差异;软骨下成骨细胞RT-PCR检测结果显示:模型组与假手术组相比较,模型组软骨下成骨细胞中TLR4、My D88、TRAF6、NF-κBp65、TNFα的表达均上调,而模型组mi RNA-146a表达明显下调,有显著性差异,P<0.05,蠲痹胶囊组与模型组比较,软骨下成骨细胞中TLR4、My D88、TNFα的表达均下调,而mi RNA-146a表达明显上调,有显著性差异,P<0.05,TRAF6、NF-κBp65表达的差异无统计学意义,安必丁组与模型组比较,软骨下成骨细胞中TLR4、My D88的表达均下调,mi RNA-146a表达明显上调,有显著性差异,P<0.05,而TRAF6、NF-κBp65、TNFα表达的差异无统计学意义,蠲痹胶囊组与安必丁组比较,软骨下成骨细胞中TNFα表达有差异,P<0.05,而mi RNA-146a、TLR4、My D88、TRAF6、NF-κBp65表达均无显著差异,P>0.05。结论:(1)实验从5月龄雌性豚鼠OA模型分离提取的原代细胞经鉴定证实为成纤维样滑膜细胞和软骨下成骨细胞。(2)补肾益气方蠲痹胶囊可通过上调mi RNA-146a及下调TLR4、My D88、TRAF6、NF-κBp65、TNFα的表达,降低细胞内IL-1β、MMP-13、TNFα水平,调控成纤维样滑膜细胞内的炎症免疫反应,从而抑制滑膜炎症免疫反应,发挥治疗骨性关节炎的作用。(3)补肾益气方蠲痹胶囊可通过上调mi RNA-146a及下调TLR4、My D88、TNFα的表达,降低细胞内IL-1β、MMP-13、TNFα水平,调控软骨下成骨细胞的炎症免疫反应,发挥治疗骨性关节炎的作用。