论文部分内容阅读
近年来,HIV病毒在全球范围内呈现快速流行态势。HIV抗体诊断试剂作为目前初步诊断HIV的主要方法,具有巨大的市场价值。随着生物技术的发展,利用基因工程的手段,制备具有良好免疫反应性的HIV-1 gp41重组抗原原料,对于HIV抗体诊断试剂的研发有着深远意义。本文首先合成了经过密码子优化的gp41基因质粒模板pET-28a(+)-gp41,PCR扩增获得了包含gp41主要优势抗原表位以及膜外重要结构域(NHR、CHR、 MPER)的截短基因序列。通过在gp41截短片段上游添加亲水性分子伴侣DsbA,在大肠杆菌体内实现了gp41优势抗原表位蛋白的融合表达。在优化表达条件下(37℃,0.2 mM IPTG,诱导后培养时间10 h),融合蛋白表达水平为8.7 μg/mL鉴于gp41融合蛋白在大肠杆菌体内表达的水平较低,无法满足制备gp41抗原的要求,本研究进而利用大肠杆菌体外无细胞体系表达gp41蛋白。利用PCR克隆gp41全长基因,成功构建无细胞表达重组质粒pIVEX2.4c-gp41,在大肠杆菌无细胞体系中实现了gp41全长蛋白的表达。进一步考察去污剂重悬目标蛋白和直接在无细胞体系中添加去污剂两种模式对获得可溶gp41蛋白的影响。结果显示,所尝试的各种去污剂均不能有效重悬gp41蛋白沉淀;而直接添加去污剂模式在最优条件下(添加终浓度为0.2%的Brij78),可溶gp41蛋白的表达水平达到650μg/mL。对添加去污剂模式所表达的可溶gp41重组蛋白进行纯化、浓缩和替换缓冲液,蛋白纯度达到95.6%,浓度为1.5 mg/mL,总回收率为70%。利用纯化后的gp41重组蛋白制备乳胶法免疫层析试纸,通过对不同抗体滴度HIV-1阳性标本、HIV-1阴性标本、TP阳性标本以及HBeAb阳性标本的检测,证明该gp41重组蛋白免疫反应性良好。总之,本文致力于HIV-1 gp41在大肠杆菌体内和体外无细胞体系的重组表达研究。通过对无细胞表达体系的优化,实现了gp41的全长可溶表达,亲和纯化获得的目标蛋白经乳胶法试纸评估具有免疫反应性。本研究为HIV抗体诊断试剂的研发提供了具有潜在应用价值的gp41抗原。