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研究背景:胆囊癌(Gallbladder Cancer,GC)是一种胆系原发性恶性肿瘤,在临床上十分常见。因其恶性程度较高,癌症细胞生长速度快,患此病的患者预后都很差。又由于胆囊癌往往在患者确诊前就有很大可能出现癌细胞的转移,使得患者接受手术切除的治疗手段后,极易复发。且患者手术切除后,5年生存率也相较于其他癌症较低,仅有2%-5%。另外,胆囊癌细胞对化疗药物不是十分敏感,采用放射治疗对胆囊癌疾病进行辅助治疗也很难取得显著的疗效。因此,目前临床上迫切需要研究和发展新的胆囊癌治疗方法,而基因治疗成为了科学家们所关注的焦点。其中siRNA采用与癌症细胞中的目标基因的反义核苷酸链,通过碱基互补的效应来达到抑制mRNA翻译/合成蛋白质的目的,从而在表观遗传学的层面沉默了目标基因的表达,目前该策略已经成为研究癌症基因治疗的一种常用策略,其中癌症相关基因EIF5A2基因已经在其他类型的癌症上有较多研究,而关于胆囊癌的EIF5A2基因的研究则鲜有报道。[目 的]采用iRNA技术,将靶向siRNA干扰片段转入进胆囊癌GBC-SD细胞系中,从而抑制EIF5A2基因的表达,通过Western Blot技术和Q-PCR技术进行验证,并运用CCK-8检测、Transwell实验技术和方法,对EIF5A2基因如何影响人胆囊癌细胞系的生物学功能进行探究,主要侧重于体外迁移、增殖能力,以及侵袭能力等方面。从而为胆囊癌的临床诊断、治疗、预后发展提供新型分子靶点和更多的理论、实验依据。[方 法]1.设计、合成siRNA后,通过脂质体介导的方式瞬转进胆囊癌细胞,在培养24h和48h后,通过Western blot实验和Q-PCR实验分别检测EIF5A2蛋白和EIF5A2mRNA在胆囊癌细胞系中的表达,验证转染进胆囊癌细胞内的靶向siRNA对EIF5A2基因的沉默效果,以筛选出合适的siRNA。2.筛选出符合条件的siRNA,通过脂质体介导的方式瞬转进胆囊癌细胞,在转染24h后,采用CCK8方法来探究胆囊癌细胞的体外增殖能力的变化情况。3.筛选出符合条件的siRNA,通过脂质体介导的方式瞬转进胆囊癌细胞,在转染48h后,采用Transwell方法来探究胆囊癌细胞在Transwell板上的迁移和侵袭能力的变化。[结 果]1.转染siRNA的胆囊癌细胞的EIF5A2基因的相对表达量的平均2-ΔΔCt值为0.673±0.132,而未转染siRNA的胆囊癌细胞的EIF5A2基因的相对表达量的平均2-ΔΔCt值为4.771±0.514。转染组与未转染组在EIF5A2基因的相对表达量上有明显的数理统计差异(P<0.05),此外Western blot检验中转染组的条带显著弱于未转染组。说明本实验中设计siRNA——NM 020390_siRNAl 12在RNA水平和蛋白质水平对胆囊癌细胞的EIF5A2基因具有抑制作用。2.CKK-8实验检测胆囊癌细胞的增殖能力。在转染siRNAOh和12h后,转染组与未转染组的A450吸光度值无明显统计学差异,P值分别为0.732、0.172。而在转染24h,36h以及48h后,转染组与未转染组的A450吸光度值出现了明显统计学差异,P值均小于0.05。3.在Transwell板检测胆囊癌细胞的迁移实验中,转染组的胆囊癌细胞三个小室的平均数量是91.67个,而未转染组的三个小室的平均数量是162.31个。通过统计学分析表明二者具有显著的数理统计差异(P=0.004<0.05)。在Transwell板检测胆囊癌细胞的侵袭实验中,转染组的胆囊癌细胞三个小室的平均数量是61.58个,而未转染组的胆囊癌细胞三个小室的平均数量达到了 140.12个,统计学学分析表明二者具有显著的数理统计差异(P=0.007<0.05)。[结 论](1)本研究通过Q-PCR验证和Western blot检测验证了 siRNA——NM 020390_siRNAl 12在RNA水平和蛋白质水平对胆囊癌细胞的EIF5A2基因具有抑制作用。(2)通过靶向沉默胆囊癌细胞的EIF5A2基因的表达,能够抑制胆囊癌细胞的增殖。(3)靶向沉默胆囊癌细胞的EIF5A2基因后,经Transwell法检测了胆囊癌细胞的迁移和侵袭能力,结果表明:沉默胆囊癌细胞的EIF5A2基因的表达后,其迁移能力和侵袭能力受到了显著的抑制。