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目的:检测胰腺癌组织及细胞株中HCCR的表达,并探讨其表达与临床病理特征之间的关系。在胰腺癌细胞株PANC1中,研究表皮生长因子EGF经PI3K/Akt/mTOR信号转导通路诱导HCCR表达上调的分子机制。方法:1、构建胰腺癌组织芯片共178例胰腺癌及47例癌旁胰腺组织和良性肿瘤组织,应用免疫组织化学染色法检测HCCR、survivin在胰腺癌组织及癌旁正常胰腺组织中的表达情况。应用Western blot技术检测胰腺癌组织、癌旁组织以及胰腺癌细胞株中HCCR的表达。应用免疫荧光技术检测HCCR在胰腺癌细胞系PANC1、sw1990、CFPAC1中的亚细胞表达定位。2、胰腺癌细胞PANC1分别以不同浓度EGF(0、50、100、200ng/ml)培养24h,100ng/ml浓度EGF培养不同时间(0、8、16、24、48、72h),用Western blot法检测细胞中HCCR蛋白的表达变化;并选择EGF诱导HCCR表达增加的适当浓度及处理时间。3、选择EGF100ng/ml处理PANC1细胞不同时间(0、2、5、10、20、30min),以Western blot法检测细胞中p-Akt水平的变化。将PANC1细胞分别先以PI3K和mTOR特异性抑制剂(分别为LY294002及rapamycin)预处理1h,再加入EGF100ng/ml培养24h,用Western blot法检测细胞中HCCR蛋白的表达变化。4、采用脂质体介导的基因转染法,将含有活性型Akt(constitutivelyactive Akt)、缺陷型Akt(dominant negative Akt)及HCCR1的质粒转染到PANC1胰腺癌细胞株,克隆环挑取细胞克隆,Western blot技术筛选阳性克隆,并检测转染细胞中HCCR蛋白水平,RT-PCR法检测HCCR的mRNA水平的变化。MTT法检测转染细胞的增殖能力。结果:1、HCCR蛋白在胰腺癌组织和细胞系中的表达免疫组化及免疫荧光检测显示HCCR表达主要定位于细胞胞膜和胞浆。HCCR和survivin在胰腺癌组织中的阳性表达率分别为77.5%(138/178)、78.3%(137/175),均高于其在癌旁组织及良性肿瘤组织中的表达,两者相比均有统计学意义(P＜0.05)。Western blot检测胰腺癌组织中HCCR表达显著高于癌旁组织。胰腺癌细胞系(PANC1、CFPAC1、SW1990)中HCCR均呈过表达。2、HCCR蛋白表达与临床病理特征之间的关系HCCR蛋白表达与病理分化程度相关(x~2=8.506 P＜0.05),分化程度低的组织中HCCR表达较强。HCCR表达率与淋巴结转移及神经浸润无明显相关。HCCR与survivin两者之间存在协同表达(r=0.236,P=0.002)。3、EGF诱导胰腺癌细胞系PALNC1中HCCR的表达增加在PANC1细胞中以100ng/ml EGF处理16、24、48、72h后HCCR表达较未处理组逐渐升高,呈时间依赖。不同浓度EGF培养细胞24h,在浓度为100、200ng/ml出现HCCR表达增加,呈剂量依赖。结果显示100ng/ml EGF浓度培养24h能明显诱导HCCR表达增加,选择此条件为后续实验的浓度和时间。4、EGF经PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导HcCR的表达。(1)EGF诱导PANC1细胞中Akt活化。EGF(100ng/ml)处理细胞2min,p-Akt水平即明显升高,其后逐渐下降。(2)HCCR的表达依赖细胞内Akt活化的水平。转染活性Akt的PANC1细胞中HCCR蛋白及mRNA水平较对照组升高,而转染缺陷Akt细胞中其蛋白及mRNA水平下降。(3)应用PI3K、mTOR的特异性抑制剂(LY294002、rapamycin)预处理PANC1细胞后,均能阻断EGF所诱导的HCCR表达增加。提示EGF通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调节HCCR的表达。5、HCCR的过表达促进细胞的增殖PANC1细胞转染HCCR1,MTT法检测转染组及对照组细胞的增殖能力,转染组细胞增值能力较对照组增强。结论:1、HCCR表达定位于胰腺癌细胞的胞膜和胞浆,胰腺癌组织及细胞系中HCCR呈高表达。HCCR表达与细胞分化程度呈正相关,提示其可能参与胰腺癌的发生发展。HCCR与survivin存在协同表达,两者可能参与P53信号通路调控细胞凋亡。2、EGF能诱导胰腺癌PANC1细胞系中HCCR表达增加,并具有时间、剂量依赖性。EGF通过激活PI3K/Akt/mTOR信号转导通路诱导HCCR的表达。HCCR过表达能促进胰腺癌细胞PANC1的增殖。