脱氧雪腐镰刀菌烯醇产毒菌的筛选及产毒分子机制探究

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脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)又称呕吐毒素(vomitoxin),主要是禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、黄色镰刀菌(Fusarium culmorum)等多种镰刀菌属真菌在生长过程中产生的次级代谢产物,具有典型的细胞毒性、免疫毒性和遗传毒性。作为一种世界范围性污染物,我国每年都在收获的小麦、玉米等谷物中检出DON,且浓度超过现有国家限量标准,严重影响着农产品的品质和质量安全。鉴于DON在谷物中存在的普遍性,对病原菌致病机理、DON合成途径及产毒机制进行研究至关重要,从而可以针对性地调节病原菌的代谢,减少DON的合成。本论文以DON高产毒F.graminearum和不产毒F.graminearum为研究对象,研究了F.graminearum产生DON的生物途径及分子机制,主要研究成果如下:(1)利用特异性引物快速筛选法和高效液相色谱法相结合的方法,从赤霉病粒小麦中筛选到7株镰刀菌,其中6株为DON产毒菌株,1株为阴性菌株。测序分析DON高产毒菌株Fg1和不产毒菌株Fg2的5.8S rDNA-ITS区基因序列,并对其形态学进行鉴定,确定两株菌株均为禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)。(2)实验室条件下研究了不同碳源、氮源、无机盐、温度、pH值等因素对DON高产毒菌F.graminearum Fg1生长和产毒量的影响。结果表明,培养条件不同,菌株的生长和产毒量有较大差异。以糊精为碳源,酵母膏为氮源,基质pH为8.0,培养温度为25℃时,F.graminearum Fg1菌株生长较佳,产毒量最高。(3)通过蛋白质组学技术,对DON高产毒菌株F.graminearum Fg1和不产毒菌株F.graminearum Fg2的差异表达蛋白进行了分析比较。结果显示,两株菌株多种基础代谢相关蛋白,氧化还原调节蛋白,次级代谢产物合成蛋白,信号传导蛋白,分子伴侣等调节性蛋白具有较大差异性。其中甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、2,3-二磷酸甘油酸变位酶(PGAM)、丙酮酸脱氢酶(PDH)、FAD结合单加氧酶(FADMO)、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基赤藓糖激酶(CMK)和萜类合成酶(TPS)等参与DON合成的相关蛋白在F.graminearum Fg1中表达明显上调。(4)通过转录组分析技术,对DON高产毒菌株F.graminearum Fg1和不产毒菌株F.graminearum Fg2的差异表达基因进行分析比较,并运用qRT-PCR技术对12个与DON合成相关基因进行验证。结果显示,11个基因为DON生物合成的正调控基因,1个基因为DON生物合成的负调控基因。其中,编码糖酵解途径相关酶的基因包括葡萄糖激酶基因(FGSG08774)、2,3-二磷酸甘油酸变位酶基因(FGSG06055)、磷酸甘油酸激酶基因(FGSG03992)、烯醇化酶基因(FGSG01346)在F.graminearum Fg1中表达明显上调;编码萜类化合物合成相关酶的基因乙酰辅酶A合成酶基因(FGSG00330)、O-乙酰基转移酶基因(FGSG03124)、异木霉醇C-15羟化酶基因(FGSG03191)、细胞色素P450单加氧酶基因(FGSG01284)、双功能植物毒素合成酶基因(FGSG12082)在F.graminearum Fg1中表达明显上调;编码MAPKs途径相关的酶包括丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Psk1基因(FGSG00469)、丝氨酸苏氨酸/蛋白激酶Cek1基因(FGSG01312)在F.graminearum Fg1表达中明显上调;编码转录因子Atf1的基因(FGSG10142)在F.graminearum Fg1表达中明显下调。
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