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piRNA是2006年发现的一类生殖系细胞特异性小分子非编码RaNA(sncRNA),因为它们特异性地与Piwi家族蛋白质相互作用,因此被命名为Piwi相互作用RNA(Piwi-interacting RNA),简称piRNA。Piwi是生殖系细胞特异性的Argonaute家族蛋白。早期的研究表明,Piwi在原始生殖细胞发生、生殖干细胞自我更新的维持和配子发生等一系列生殖相关事件中具有不可或缺的重要作用。最近的研究发现,piRNA的生成及功能都依赖于Piwi家族蛋白质;同样,piRNA在Piwi蛋白的许多功能中也必不可少。推测Piwi/piRNA复合物可能通过切割靶RNA、抑制靶mRNA翻译、介导基因组DNA甲基化修饰和染色质组蛋白修饰等作用机制,在转录后水平和表观遗传水平调控靶基因的表达,抑制转座子和重复序列等自私性遗传元件的活性,维持生殖细胞基因组的稳定性和完整性。 本文中,作者以小鼠Piwi蛋白-MIWI为主要研究对象,发现细胞周期后期促进复合物(APC/C)与MIWI相互作用。APC/C复合物具有泛素连接酶(E3)活性,通过介导多种细胞周期相关蛋白质因子的降解,在细胞周期调控中发挥重要作用,为细胞有丝分裂和减数分裂所必需。发现,MIWI与APC/C之间存在两种相互作用模式:在没有piRNA条件下,MIWI蛋白主要通过APC7等含TPR结构域的亚基与APC/C相互作用;而在piRNA存在条件下,MIWI则主要通过底物结合亚基APC10与APC/C相互作用。进一步的研究发现,这两种作用模式涉及不同的功能。 首先对piRNA存在条件下MIWI与APC/C相互作用的功能和机制进行了探索。通过序列分析,发现MIWI蛋白的N-端存在一个APC/C底物特征性序列元件-D-box,而且该元件保守地存在于脊椎动物Piwi蛋白的N-端,提示MIWI蛋白可能是APC/C的底物。有趣的是,发现piRNA是APC/C介导的MIWI泛素化修饰的必要条件;进一步的研究提示,piRNA结合可能会引起MIWI蛋白构象的改变,促进MIWI与底物结合亚基APC10的相互作用,进而MIWI被APC/C作为底物识别并泛素化修饰,最终导致MIWI蛋白通过泛素.蛋白酶小体途径被降解。与此同时,发现内源MIWI蛋白的泛素化修饰仅出现在成年小鼠睾丸和后期精子细胞中,这与之前发现的MIWI逐渐在后期精子细胞中消失一致。基于研究结果,提出了MIWI/piRNA复合物在精子发育后期协同清除的模型:在后期精子细胞中,piRNA高度结合MIWI,促进MIWI进入APC/C酶活性中心,启动了APC/C介导的MIWI泛素化修饰和降解;鉴于MIWI是小鼠后期精子细胞中最后一个Piwi蛋白,MIWI蛋白的降解导致piRNA的释放,而失去了蛋白质保护的游离piRNA随即被细胞内的RNase迅速降解;此外,最后一个Piwi蛋白的降解也使Piwi蛋白依赖的piRNA生成途径中断。因此,通过这样一个负反馈环路,MIWI蛋白和piRNA在后期精子细胞中同时被清除。更重要的是,还发现MIWI/piRNA复合物在后期精子细胞中的正常清除为精子成熟所必需,表明该通路具有重要的生物学功能。 作者同时还对piRNA不存在条件下MIWI与APC/C相互作用的功能和机制进行了探索。发现在哺乳动物Piwi蛋白的N-端还存在一个APC/C激活因子特征性序列元件-C-box,提示MIWI蛋白可能是APC/C的激活因子。在体外APC/C反应系统和293T细胞中,MIWI均提高Cyclin B1(APC/C经典底物之一)的泛素化修饰水平;并且,在293T细胞中瞬转表达MIWI促进Cyclin B1的降解,同时对细胞增殖和细胞周期有调控作用;在小鼠精母细胞GC-2中,通过shRNA下调内源MIWI蛋白的表达,抑制细胞增殖并影响细胞周期。此外,发现MIWI和APC7分别通过MIWI的N.端结构域和APC7的TPR结构域相互作用,C-box序列的突变则消除了MIWI与.APC7的相互作用以及MIWI对Cyclin B1降解的促进作用,提示MIWI通过其N-端的C-box序列作为激活因子促进APC/C的E3活性,介导细胞周期调控。有趣的是,piRNA强烈抑制MIWI与APC7相互作用,提示piRNA可能是MIWI作用为APC/C激活因子还是底物的决定因子;鉴于发现在精母细胞中MIWI几乎不结合piRNA,推测MIWI可能在精母细胞中充当APC/C激活因子,参与调控减数分裂。后续研究将对MIWI作为APC/C激活因子的功能及作用机制进行深入研究。 综上所述,本文对MIWI/piRNA机器与APC/C复合物之间的相互作用机制及功能进行了探索,揭示了MIWI蛋白和piRNA代谢的分子机制和生物学功能,并提出了MIWI可能具有调控减数分裂的新功能,有助于深入了解Piwi/piRNA在生殖细胞中的功能和作用机制。