三七病毒病病原种类鉴定及其相关病毒分子变异分析

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三七是我国中药材中的一颗明珠,具有非常重要的药用和医疗保健价值。但因其特殊的生长、管理条件,很容易造成病毒病的发生,该病害的发生严重影响三七的生活力,降低三七的产量和质量,对生产构成严重的威胁。但到目前为止,有关三七病毒病的研究很少,而且现有的研究也仅仅停留在三七病毒病原物的鉴定层面上。植物病毒病被称作是“植物的癌症”,防治植物病毒病最重要的工作首先就是要明确病毒病原物,然后才能通过分析各个病原物的传播方式、寄主范围及发生规律等方面防控病毒病的发生。鉴于此,本文旨在通过对三七病毒病病原物开展进一步的鉴定研究,探明三七病毒中除三七Y病毒(Panax virus Y,PnVY)外的其他种类及优势种,明确其寄主范围,确定病毒分离物/复合体与症状类型的相关性,为进一步深入开展相关病毒的致病性分子机理、病害的监测和预报以及有效防控提供坚实的理论基础和技术指导,并对国内外该领域的相关研究工作起到一定的借鉴和推动作用。本文以三七病叶为材料提取dsRNA及提纯病毒,并尝试以dsRNA为模板构建cDNA文库得到可能的病毒种类,以三七病毒提纯产物为材料通过电镜技术和SDS-PAGE、质谱分析技术分别进行病毒粒子形态观察及可能的病毒种类初步鉴定。结果经dsRNA、提纯病毒及电镜技术等再次验证三七病样除了PnVY之外还存在不止一种病毒病原物。而由于提取的dsRNA浓度过低,致使没能成功完成对cDNA文库的构建。质谱分析的结果显示三七病样中可能存在大豆矮缩病毒(Soybean dwarf virus,SbDV),但经SbDV特异性引物检测及序列分析,并未在该批三七病样中检测到SbDV。应用双生病毒(geminiviruses)的基因组DNA及卫星(betasatellite)的DNA检测通用引物和中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV)的特异性引物,在三七病样YWSh03中检测到了的TYLCCNV和TYLCCNB,并获得了TYLCCNV和TYLCCNB的全长基因组序列。然后将含有TYLCCNV及TYLCCNB侵染性克隆的农杆菌菌悬液、菌落接种至三七叶片上,并且通过获毒的粉虱对三七进行传毒试验。结果农杆菌接种的三七苗都表现为黄化症状,而粉虱传毒的三七苗症状不明显,但通过PCR检测均能检测到TYLCCNV和TYLCCB。通过分子生物学和生物学的方法证实了TYLCCNV及TYLCCNB对三七的侵染,完成了柯赫氏法则的验证,这是TYLCCNV及TYLCCNB侵染人参属植物的首次报道。以三七病叶、dsRNA和病毒提纯产物为接种材料,将其摩擦接种于供试植株中,接种一月之久,大部分寄主表现出褪绿黄化的症状,但经RT-PCR检测后,PnVY的寄主只有有茄科的黄烟、辣椒和豆科的豇豆。对文山、红河、昆明、曲靖等地的三七种植园进行了病害调查和相关病毒的检测。发现三七病毒病的症状类型多样,发病率逐年增加,且田间表现复合症状的居多。初步建立了PnVY和TYLCCNV的双重PCR检测体系,该体系能够快速及时准确的对三七田间这两种病毒的发生开展检测及分析。运用双重PCR检测体系对不同地区三七病样的PnVY和TYLCCNV的带毒率进行检测,发现由两种病毒复合侵染的现象较多,复合侵染率在38.7%~50.0%之间,且从整体来讲,PnVY对三七的侵染率最高。获得了5个PnVY分离物的全基因组序列、6个TYLCCNV分离物基因组全序列及4个TYLCCNB的基因组全序列,并对其进行基因组结构分析及系统进化分析,推测三七病毒病复杂多样的症状类型可能与TYLCCNV及TYLCCNB无太大相关性,但可能与PnVY的基因组结构相关,尤其是PnVY的P1蛋白可能与三七症状多样性相关。
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