细胞周期包括间期和分裂期,间期时遗传物质进行复制,而分裂期时遗传物质进行平均分配。也有些细胞经过多次分裂之后,处于停止分裂的静止期,称为GO期,细胞周期开始于这个时相。染色体的分配是通过由中心体和微管以及其他的动力蛋白组成的纺锤体实现的,纺锤体将高度螺旋化的染色体牵引向细胞的两级。中心体由两个中心粒组成,而中心粒包括由微管组成的三联体。微管是一种 ’具有极性的细胞骨架,由微管蛋白α/β-tubulin二聚体组成的长管状细胞器结构,ca-tubulin和β-tubulin具有高度同源性,α-tubulin是组成微管的基础之一。本课题使用三类不同来源和类型的细胞分别对应于生物体内存在的细胞周期相关可能的三种情况对本课题的兴趣基因和蛋白ea-tubulin在细胞周期中的分布模式进行探讨和研究。第一类细胞来自小鼠早期胚胎,其具有典型的全部细胞周期的各时相。胚胎细胞具有极强的有丝分裂能力,并且通常认为不具有进入GO时相的特性,我们选1-细胞期,2-细胞期,4-细胞期和8-细胞期的小鼠胚胎为实验材料,探究在无GO时相下细胞周期中α-tubulin的功能;第二类细胞是小鼠巨噬细胞株Raw264.7,它既有分化能力,也保持有丝分裂特性。以M2期的巨噬细胞为对象对比探讨在保持分裂能力以及进入一定分化状态下的周期时相中α-tubulin的动态变化和经尼古丁处理的高度分化动态状态的可能改变。第三类细胞是取自小鼠腹腔的已经分化完全的巨噬细胞,其仅处于G0时相,以此为材料研究α-tubulin在小鼠原代巨噬细胞中即相对稳定的静止于细胞周期中的GO时相状态下的功能,并且将此原代细胞与上述同时具有有丝分裂和一定的定向分化的细胞Raw264.7相互对比,探究极端分化中我们兴趣蛋白的表现异同。本课题中使用的腹腔巨噬细胞被认为是哺乳动物体内免疫系统的第一防线,具有很高的运动能力和对异物的吞噬能力,具有分化顶端的特性,而该特性与作为细胞骨架蛋白的α-tubulin的重要关系目前尚不清晰,该方面ca-tubulin的相关分子机制在众多的医学生物学问题上意义重大。本课题还对抗动物血清的制备提供了一些新的方法,以便于日后获得胚胎干细胞从而更好地用胚胎干细胞研究ca-tubulin在细胞周期的分布模式。结果显示:(1)小鼠早期胚胎细胞中,α-tubulin蛋白免疫荧光染色和激光扫描共聚焦显微镜拍摄结果显示:1-细胞期胚胎处于细胞周期的分裂期,α-tubulin聚合构成纺锤体参与细胞分裂的进程。而2-细胞期,4-细胞期,6-细胞期,7-细胞期和8-细胞期的胚胎中,处于细胞周期的间期,此时α-tubulin未如通常认为的解聚或呈低聚态,而是聚合成中间有断点的中心体连体连接着两个相邻细胞,随着分裂次数的增加,中心体横截面在逐渐降低。RNA干扰实验表明,敲低α-tubulin的表达后,会有多中心体和多核胚胎出现,说明α-tubulin在胚胎分裂中起重要作用。(2)不同细胞周期状态下的巨噬细胞中,α-tubulin蛋白免疫荧光染色和倒置荧光显微镜拍摄结果显示:未经尼古丁处理培养48 h的小鼠巨噬细胞株Raw264.7中,α-tubulin在细胞周期分裂期聚合组装成纺锤体,而在2.55%的细胞的间期中聚合成中心体连体连接着两个相邻的细胞,大部分在GO期聚合成中心体参与细胞进程。经尼古丁处理培养48 h的Raw264.7细胞中,细胞处于GO期,α-tubulin聚合组装成中心体。未经尼古丁处理和经尼古丁处理培养48 h的小鼠腹腔原代巨噬细胞中,细胞均处于GO期,α-tubulin均呈聚合状分散在细胞中参与其他细胞进程。统计学数据显示,经尼古丁处理的细胞面积比未经尼古丁处理的细胞面积大,且两者之间存在极显著差异。(3)处于细胞周期GO时相极端分化下巨噬细胞的活细胞工作站拍摄结果显示:未经尼古丁处理的巨噬细胞运动是整体的迁移,胞体和尾部在迁移的过程中整体移动,细胞的长短在迁移过程中没有发生太大的变化。经尼古丁处理之后的巨噬细胞运动是非整体的迁移,尾部在一位置固定不动,而胞体在向外伸长,使得在迁移过程中细胞的尾部越拉越长。尼古丁的处理会降低巨噬细胞的迁移速度,但在尼古丁处理后第六天,速度恢复。统计学数据显示经尼古丁处理之前与之后的巨噬细胞长度相比具有极显著差异。(4)体外建立胚胎干细胞体系过程中抗动物血清的制备:用大白猪脾脏细胞提取液和梅山猪脾脏细胞提取液分别对两组实验兔进行免疫,成功获得兔抗大白猪血清和兔抗梅山猪血清,为日后猪TE细胞的解体打下基础。结论:本课题运用免疫荧光细胞化学染色技术、RNAi方法、RT-PCR方法,从基因和蛋白水平上研究细胞骨架蛋白cα-tubulin在细胞周期的动态变化。研究显示,在细胞周期中,α-tubulin有三种聚合形式,一种是分裂期中参与核分裂的纺锤体,一种是间期中连接于两细胞之间的中心体连体,一种是GO期的中心体和分散于细胞中的聚合体。敲低α-tubulin表达后,会有多中心体和多核胚胎出现。说明α-tubulin的聚合和解聚在细胞周期中起重要作用。通过对小鼠早期胚胎分裂中α-tubulin的分布进行研究以期为早期胚胎发育中的细胞有丝分裂研究提供参考数据,也可以以小鼠的早期胚胎发育模式来为人类的早期胚胎发育分子机制的研究提供新的方向。