论文部分内容阅读
WIN 55,212-2是一种大麻素受体激动剂,可以激活大麻素受体,已经证明它具有抗肿瘤作用。WIN可以抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞的凋亡。然而,WIN在骨肉瘤中的作用和机制仍不清楚。自噬是一种细胞溶酶体降解途径,在维持细胞内稳态、调节细胞存活和死亡方面起着至关重要的作用。抑制细胞自噬反应的发生可增强化疗药物诱导的肿瘤细胞凋亡。内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)与自噬密切相关,这两个过程的联合作用在保护细胞存活或触发细胞死亡方面均发挥重要作用。因此,围绕内质网应激和自噬的治疗策略为肿瘤治疗提供了新思路。在这项研究中,我们考察了 WIN55,212-2对骨肉瘤细胞系Saos-2在细胞活力和凋亡方面的影响。同时,我们进一步探讨了WIN55,212-2诱导的内质网应激和自噬在细胞凋亡中的作用。本课题包括以下2部分:第一部分:WIN55,212-2对骨肉瘤细胞的生物学作用。第二部分:自噬和内质网应激在WIN55,212-2诱导的骨肉瘤细胞凋亡中的作用。第一部分:WIN5W,252-2对骨肉瘤细胞的生物学作用目的:本部分初步考察WIN55,212-2对骨肉瘤细胞的生物学作用。方法:SAOS-2骨肉瘤细胞经WIN作用后,MTT方法检测细胞存活率,AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率。JC-1染色流式细胞仪检测WIN对SAOS-2骨肉瘤细胞线粒体膜电位。免疫印迹技术检测凋亡通路相关蛋白(Cytochrome C、caspase-3 和 PARP)的表达。结果:MTT结果显示WIN可显著降低SAOS-2细胞生存率,并呈剂量和时间依赖性。Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测结果显示WIN可明显增加SAOS-2细胞凋亡率,JC-1染色显示WIN明显的呈剂量依赖性地降低线粒体膜完整性的比率。western blot结果显示,WIN明显上调了线粒体凋亡相关蛋白cleaved Caspase-3,cleaved PARP 和细胞色素 C 表达。结论:WIN55,212-2可通过线粒体凋亡途径诱导Saos-2细胞凋亡。第二部分:自噬和内质网应激在WIN55,212-2诱导的骨肉瘤细胞凋亡中的作用目的:本部分考察自噬和内质网应激在WIN55,212-2诱导的骨肉瘤细胞凋亡中的作用。方法:SAOS-2骨肉瘤细胞经WIN单独,和或内质网应激激动剂和抑制剂,自噬抑制剂联用后,MTT方法检测细胞存活率,Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率。免疫印迹技术检测细胞凋亡通路相关蛋白(caspase-3蛋白和PARP蛋白),内质网应激相关蛋白(GRP78,IRE,TRB3)和细胞自噬相关蛋白(LC3,Beclin1和p62)表达水平。结果:经WIN处理后,GRP78、IRE和TRB3表达随着药物浓度的增加而明显的增加,LC3-Ⅱ和Beclin1随着药物浓度的增加而明显的增加,而p62表达水平明显下降。内质网应激抑制剂4-PBA和TUDC可以缓解由WIN诱导的细胞毒性,相反,内质网应激激活剂TG和TUNI增加了由WIN诱导的细胞毒性。4-PBA对内质网应激的抑制减少了 WIN诱导的凋亡,TG激活内质网应激增加了WIN诱导的凋亡。联合自噬抑制剂3-MA/CQ可以进一步增加细胞凋亡率及凋亡蛋白 cleaved PARP 和 cleaved caspase 3 的表达结论:WIN55,212-2可诱导骨肉瘤细胞凋亡并诱导骨肉瘤细胞发生内质网应激和自噬,增强内质网应激和抑制自噬均可以明显增强WIN55,212-2诱导的骨肉瘤细胞凋亡,因此,WIN55,212-2与自噬抑制剂或内质网应激激活剂结合可以为骨肉瘤治疗提供了新思路。