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敬钊蜘蛛(Chilobrachys jingzhao)是生长于我国南方的一种具有毒性的狼蛛,其毒液中成分十分复杂。目前已从敬钊狼蛛中分离纯化出了超过60种毒素多肽。而敬钊毒素3(Jingzhaotoxin-III,JZTX-III)就是从此种狼蛛中分离纯化得到的一种多肽类神经毒素。JZTX-III由36个氨基酸残基组成,并且含有3对二硫键。它能够选择性地作用于分布在心肌细胞膜上的人的钾离子通道h Kv2.1和人的钠离子通道h Nav1.5,具有较高的研究价值。由于从天然蜘蛛毒液中分离得到JZTX-III的量很少,并且尚未通过原核表达的方法获得此种毒素,我们将利用半乳糖自动诱导系统帮助E.coli SHuffle T7 Express菌种原核表达JZTX-III以提高其产量。通过优化,我们得到最佳自动诱导条件为30℃、220 rpm震荡培养16 h,并且在此条件下经过镍柱和RP-HPLC纯化得到的r JZTX-III的产量高达12.1 mg/L。质谱结果显示r JZTX-III具有正确的分子量,说明表达成功。后期电生理实验结果也表明r JZTX-III具有对h Nav1.5的抑制活性。为证明此表达系统具有一定的适用性,我们还利用半乳糖自动诱导系统表达r JZTX-46。JZTX-46是从敬钊狼蛛毒腺所构建的DNA文库中发现的一类功能未知的毒素,它由30个氨基酸残基构成并且含有3对二硫键。经过质谱检测,表达纯化得到的r JZTX-46的分子量与理论值吻合,说明r JZTX-46表达成功,也同时说明了半乳糖自动诱导SHuffle菌种表达富含二硫键多肽的策略具有一定的适用性。由于JZTX-46与已知的JZTX-XII的同源性很高,我们参考JZTX-XII的特异性检测了JZTX-46对h Nav1.5和h Nav1.7通道的活性,并发现无显著作用。我们还将检测其对钾离子通道及其它通道的作用。本文中我们还详细描述了用于切割r JZTX-III和r JZTX-46融合蛋白中SUMO标签的Ulp激酶的制作工艺。由于以往购买Ulp激酶的费用很高,我们利用原核表达的方法得到了较纯的Ulp激酶。经过酶切实验验证,表达Ulp激酶具有较高的活性,每1μl Ulp激酶在30℃下1 h能够切割33μg的底物。